Un rendement et une qualité élevés des cellules provenant de tissus complexes sont essentiels à l’analyse expérimentale couramment utilisée, comme le séquençage de l’ARN unicellulaire et les cultures de cellules souches primaires. Ce protocole génère des cellules saines à haut rendement et de qualité à partir de différentes régions et compartiments tissulaires de la langue des mammifères, y compris l’épithélium de la langue et le tissu conjonctif. Pour séparer l’épithélium du mesenchyme d’une langue de souris E 12,5, transférer la souris femelle gravide euthanasiée dans la zone chirurgicale et mouiller l’abdomen de la souris avec de l’éthanol à 70% pour empêcher la fourrure d’entrer dans le site opératoire.
Ouvrez l’abdomen à l’aide de ciseaux disséquants pour exposer les cornes utérines portant les embryons, disséquez les cornes utérines et transférez-les dans une solution de Tyrode fraîche de 15 millilitres dans un plat de culture de 100 millimètres. Sous un microscope à dissection, utilisez des mini-ciseaux et une pince fine pour disséquer les embryons des cornes utérines. Ouvrez la cavité buccale avec la pince fine et disséquez la langue de la mandibule à l’aide de mini ciseaux.
Lavez les langues avec 15 millilitres de solution de Tyrode fraîchement stérile dans un plat de culture de 100 millimètres. Ensuite, transférez les tissus dans deux millilitres d’un mélange enzymatique de dispase et de collagène dans une capsule de culture de 35 millimètres et incuber pendant 20 minutes à 37 degrés Celsius. Transférer les langues à 15 millilitres de solution de Tyrode stérile fraîche et séparer doucement le mésenchyme et l’épithélium de la face ventrale à l’aide d’une pince fine.
Laver l’épithélium et le mésenchyme séparés deux fois dans 15 millilitres de solution de Tyrode fraîchement stérile. Pour séparer l’épithélium de la langue du tissu conjonctif sous-jacent d’une souris adulte, transférer la souris euthanasiée dans la zone chirurgicale et mouiller la tête de la souris à l’aide de 70% d’éthanol pour empêcher la fourrure d’entrer dans la cavité buccale. Utilisez des ciseaux disséquants pour couper les coins de la bouche le long de la joue pour ouvrir la cavité buccale.
Disséquer la langue avec une mandibule, la laver et la placer dans un plat en plastique avec une couche de pellicule de plastique. En utilisant des pinces chirurgicales pour tenir la langue, injectez le mélange enzymatique de dispase et de collagénase dans l’espace sous-épithélial de la langue à travers le tranchant de la langue postérieure. Injecter un millilitre de mélange d’enzymes uniformément à la langue entière pour la collecte de tissu, puis injecter 0,5 millilitres de mélange d’enzymes localement à la langue antérieure pour la collecte de tissu de la pointe de la langue ou à la langue postérieure pour la collecte de tissu de papille circumvallate.
Enveloppez la langue avec une pellicule de plastique et incuber pendant 30 minutes à 37 degrés Celsius. Utilisez des mini-ciseaux pour disséquer la papille circumvallée et la pointe de la langue. Ensuite, transférez un tissu à 15 millilitres de solution de Tyrode fraîchement stérile.
Séparez l’épithélium du tissu conjonctif sous-jacent dans l’espace sous-épithélial digéré enzymatique à l’aide de mini ciseaux et coupez les tissus à une taille appropriée, selon les exigences des expériences en aval. Lavez l’épithélium séparé et le tissu conjonctif sous-jacent deux fois dans 15 millilitres de solution de Tyrode fraîchement stérile dans un plat de culture de 100 millimètres. Transférer les tissus dans trois millilitres d’EDTA à 0,25% de trypsine dans un nouveau plat de culture de 35 millimètres.
Incuber le plat pendant 30 minutes à 37 degrés Celsius, en agitant doucement les tissus toutes les cinq minutes avec un millilitre pipette pointes. Ajouter 500 microlitres de 5% FBS dans le DMEM F12 pour arrêter la réaction et transférer le milieu dans un tube centrifugeur à faible liaison de cinq millilitres. Centrifuger la suspension cellulaire à 200 fois G pendant huit minutes à température ambiante et retirer le surnageant.
Remettez doucement les cellules en suspension dans trois millilitres de DMEM F12 contenant 10% FBS et 1% BSA, et filtrez les cellules avec une passoire de cellules de 70 micromètres, suivie d’une passoire de cellules de 35 micromètres. Centrifuger la suspension cellulaire à 200 fois G pendant huit minutes à température ambiante, puis enlever la majeure partie du milieu, laissant 50 à 300 microlitres comme volume final pour ressusciter les cellules. Dans la langue embryonnaire de souris, un espace dans l’espace sous-épithélial est visible après une digestion enzymatique appropriée.
Dans la langue de souris adulte, une injection d’enzymes réussie est indiquée par un gonflement dans les zones injectées, ce qui suggère que l’enzyme peut être maintenue par la langue. Après avoir regroupé E12.5 tongues' feuilles épithéliales et couches minces de mesenchyme, comptage manuel de cellules a démontré que le protocole a rapporté 63, 917 cellules au total avec une viabilité de 95,2% des feuilles épithéliales, et 294, 333 cellules au total avec une viabilité de 96,3% du mesenchyme. Quand 10 langues adultes à huit semaines d’âge ont été employées, le protocole a rapporté 187, 333 cellules avec une viabilité de 95,4% des feuilles épithéliales du bout de langue, 544, 000 cellules avec une viabilité de 96,3% des feuilles épithéliales des papilles circumvallate, et 150, 500 cellules avec une viabilité de 93% des tissus conjonctifs.
Suivant ce protocole, les cellules dissociées peuvent être utilisées pour le séquençage de l’ARN unicellulaire et la culture organoïde de test 3D pour définir les cellules progénitrices d’essai non reconnues sous l’épithélium linguale.
