Alto rendimento e qualidade das células de tecidos complexos são essenciais para análises experimentais comumente utilizadas, como sequenciamento de RNA de células únicas e culturas primárias de células-tronco. Este protocolo gera células saudáveis de alto rendimento e qualidade de diferentes regiões e compartimentos teciduais da língua mamífera, incluindo epitélio de língua e tecido conjuntivo. Para separar o epitélio do mesenquime de uma língua de rato E 12,5, transfira o rato gestante eutanizado para a área cirúrgica e molhe o abdômen do rato com 70% de etanol para evitar que a pele entre no local de operação.
Abra o abdômen usando uma tesoura dissecando para expor os chifres uterinos que carregam os embriões, dissecar os chifres uterinos e transferi-los para 15 mililitros de solução de Tyrode fresco em um prato de cultura de 100 milímetros. Sob um microscópio dissecando, use mini tesoura e fórceps finos para dissecar os embriões dos chifres uterinos. Abra a cavidade bucal com os fórceps finos e disseca a língua da mandíbula usando mini tesoura.
Lave as línguas com 15 mililitros de solução de Tyrode estéril fresco em um prato de cultura de 100 milímetros. Em seguida, transfira os tecidos para dois mililitros de uma mistura enzimática de dispase e colágeno em um prato de cultura de 35 milímetros e incubar por 20 minutos a 37 graus Celsius. Transfira as línguas para 15 mililitros da solução de Tyrode estéril fresco e separe suavemente o mesenquime e o epitélio do lado ventral usando fórceps finos.
Lave a epitélio separada e mesenquime duas vezes em 15 mililitros da solução de Tyrode estéril fresco. Para separar o epitélio da língua do tecido conjuntivo subjacente de um rato adulto, transfira o rato eutanizado para a área cirúrgica e molhe a cabeça do rato usando 70% de etanol para evitar que a pele entre na cavidade oral. Use uma tesoura dissecando para cortar os cantos da boca ao longo da bochecha para abrir a cavidade oral.
Dissecar a língua com uma mandíbula, lave-a e coloque-a em um prato de plástico com uma camada de plástico. Usando fórceps cirúrgicos para segurar a língua, injete a mistura enzimática de dispase e colagem no espaço subepitelial da língua através da borda de corte da língua posterior. Injete um mililitro de mistura enzimada uniformemente na língua inteira para coleta de tecido, em seguida, injete 0,5 mililitros de mistura de enzima localmente para a língua anterior para coleta de tecido da ponta da língua ou para a língua posterior para coleta de tecido de papila circunvaltada.
Enrole a língua com plástico e incuba-a por 30 minutos a 37 graus Celsius. Use mini tesoura para dissecar a papila circunvaltada e a ponta da língua. Em seguida, transfira um tecido para 15 mililitros de solução estéril fresca de Tyrode.
Separe o epitélio do tecido conjuntivo subjacente no espaço subepitelelial digerido da enzima usando mini tesoura e corte os tecidos em um tamanho adequado, de acordo com a exigência de experimentos a jusante. Lave o epitélio separado e o tecido conjuntivo subjacente duas vezes em 15 mililitros da solução de Tyrode estéril fresco em um prato de cultura de 100 milímetros. Transfira os tecidos para três mililitros de 0,25% de trippsina EDTA em um novo prato de cultura de 35 milímetros.
Incubar o prato por 30 minutos a 37 graus Celsius, agitando suavemente os tecidos a cada cinco minutos com uma ponta de pipeta mililitro. Adicione 500 microliters de 5%FBS no DMEM F12 para parar a reação e transfira o meio para um tubo de centrífuga de baixa ligação de cinco mililitros. Centrifugar a suspensão da célula a 200 vezes G durante oito minutos em temperatura ambiente e remover o supernatante.
Resuspenque suavemente as células em três mililitros de DMEM F12 contendo 10% FBS e 1%BSA, e filtre as células com um coador de células de 70 micrômetros, seguido por um filtro de células de 35 micrômetros. Centrifugar a suspensão celular a 200 vezes G durante oito minutos em temperatura ambiente, em seguida, remova a maior parte do meio, deixando 50 a 300 microliters como o volume final para resuspend as células. Na língua do rato embrionário, uma lacuna no espaço subepiteliol é visível após a digestão adequada da enzima.
Na língua do rato adulto, uma injeção de enzima bem sucedida é indicada pelo inchaço nas áreas injetadas, o que sugere que a enzima pode ser mantida pela língua. Após a junção das folhas epiteliais e camadas finas de mesenquime, a contagem manual de células demonstrou que o protocolo produziu 63.917 células no total com uma viabilidade de 95,2% das folhas epiteliais, e 294, 333 células no total com uma viabilidade de 96,3% do mesenquime. Quando 10 línguas adultas com oito semanas de idade foram usadas, o protocolo rendeu 187.333 células com viabilidade de 95,4% de folhas epiteliais da ponta da língua, 544.000 células com uma viabilidade de 96,3% de folhas epiteliais de papilas circunvaloladas, e 150,500 células com uma viabilidade de 93% de tecidos conjuntivos.
Seguindo este protocolo, as células dissociadas podem ser usadas para sequenciamento de RNA de células únicas e cultura organoide de teste 3D para definir células progenitoras de teste não reconhecidas sob o epitélio lingual.
