L'alto rendimento e la qualità delle cellule provenienti da tessuti complessi sono essenziali per l'analisi sperimentale comunemente usata, come il sequenziamento dell'RNA a singola cellula e le colture primarie di cellule staminali. Questo protocollo genera cellule sane ad alta resa e qualità da diverse regioni e compartimenti tissutali della lingua dei mammiferi, tra cui epitelio della lingua e tessuto connettivo. Per separare l'epitelio dal mesenchima di una lingua del topo E 12.5, trasferire il topo femmina incinta eutanasiato nell'area chirurgica e bagnare l'addome del topo con il 70% di etanolo per evitare che la pelliccia entra nel sito operativo.
Apri l'addome usando forbici sezionanti per esporre le corna uterine che trasportano gli embrioni, sezionare le corna uterine e trasferirle in un 15 millilitri di soluzione di Tirolo fresco in un piatto di coltura di 100 millimetri. Al microscopio sezionato, utilizzare mini forbici e forcep fini per sezionare gli embrioni dalle corna uterine. Aprire la cavità orale con le forceps fini e sezionare la lingua dalla mattinità usando mini forbici.
Lavare le lingue con 15 millilitri di soluzione di Tirolo sterile fresco in un piatto di coltura da 100 millimetri. Quindi trasferire i tessuti a due millilitri di una miscela enzimatica di dispasi e collagene in un piatto di coltura di 35 millimetri e incubare per 20 minuti a 37 gradi Celsius. Trasferire le lingue a 15 millilitri della soluzione di Tirolo sterile fresco e separare delicatamente il mesenchima e l'epitelio dal lato ventrale utilizzando forcep fini.
Lavare l'epitelia separata e il mesenchima due volte in 15 millilitri di soluzione di Tirolo sterile fresco. Per separare l'epitelio della lingua dal tessuto connettivo sottostante di un topo adulto, trasferire il topo eutanasiato nell'area chirurgica e bagnare la testa del topo usando il 70% di etanolo per evitare che la pelliccia entrasse nella cavità orale. Utilizzare forbici sezionanti per tagliare gli angoli della bocca lungo la guancia per aprire la cavità orale.
Sezionare la lingua con una mattiglia, lavarla e posizionare in un piatto di plastica con uno strato di involucro di plastica. Usando le forcep chirurgiche per tenere la lingua, iniettare la miscela enzimatica di dispasi e collagenasi nello spazio subepiteliale della lingua attraverso il tagliente della lingua posteriore. Iniettare un millilitro di miscela enzimatica uniformemente a tutta la lingua per la raccolta dei tessuti, quindi iniettare 0,5 millilitri di miscela enzimatica localmente alla lingua anteriore per la raccolta dei tessuti dalla punta della lingua o alla lingua posteriore per la raccolta circonvallata dei tessuti di papilla.
Avvolgere la lingua con un involucro di plastica e incubarla per 30 minuti a 37 gradi Celsius. Usa mini forbici per sezionare la papilla circonvallata e la punta della lingua. Quindi trasferire un tessuto a 15 millilitri di soluzione di Tiroide sterile fresco.
Separare l'epitelio dal tessuto connettivo sottostante nello spazio subepiteliale digerito enzimatico utilizzando mini forbici e tagliare i tessuti a una dimensione adeguata, secondo il requisito degli esperimenti a valle. Lavare l'epitelio separato e il tessuto connettivo sottostante due volte in 15 millilitri di soluzione di Tirolo sterile fresco in un piatto di coltura da 100 millimetri. Trasferire i tessuti in tre millilitri di EDTA allo 0,25% di tripside in un nuovo piatto da coltura da 35 millimetri.
Incubare il piatto per 30 minuti a 37 gradi Celsius, agitando delicatamente i tessuti ogni cinque minuti con una punta di pipetta millilitro. Aggiungere 500 microlitri di 5%FBS in DMEM F12 per interrompere la reazione e trasferire il mezzo in un tubo di centrifuga a bassa legatura a cinque millilitri. Centrifugare la sospensione cellulare a 200 volte G per otto minuti a temperatura ambiente e rimuovere il supernatante.
Rimescolare delicatamente le cellule in tre millilitri di DMEM F12 contenenti 10%FBS e 1%BSA e filtrare le celle con un filtro cellulare da 70 micrometri, seguito da un filtro cellulare da 35 micrometri. Centrifugare la sospensione cellulare a 200 volte G per otto minuti a temperatura ambiente, quindi rimuovere la maggior parte del mezzo, lasciando da 50 a 300 microlitri come volume finale per rimorsi le cellule. Nella lingua embrionale del topo, uno spazio nel sottoepiteliale è visibile dopo una corretta digestione enzimatica.
Nella lingua adulta del topo, un'iniezione enzimatica di successo è indicata dal gonfiore nelle aree iniettate, il che suggerisce che l'enzima può essere tenuto dalla lingua. Dopo aver raggruppato fogli epiteliali di E12,5 lingue e sottili strati di mesenchima, il conteggio manuale delle cellule ha dimostrato che il protocollo produceva 63.917 cellule in totale con una vitalità del 95,2% dai fogli epiteliali e 294. Quando sono state usate 10 lingue adulte a otto settimane di età, il protocollo ha prodotto 187.333 cellule con una vitalità del 95,4% da fogli epiteliali della punta della lingua, 544.000 cellule con una vitalità del 96,3% da fogli epiteliali di papille circumvallate e 150.500 cellule con una vitalità del 93% dai tessuti connettivi.
Seguendo questo protocollo, le cellule dissociate possono essere utilizzate per il sequenziamento dell'RNA a singola cella e la coltura organoide di test 3D per definire cellule progenitrici di test non riconosciute sotto l'epitelio linguale.
