Высокий выход и качество клеток из сложных тканей имеют важное значение для широко используемого экспериментального анализа, такого как секвенирование РНК одной клетки и первичные культуры стволовых клеток. Этот протокол генерирует здоровые клетки с высоким выходом и качеством из различных областей и тканевых компартментов языка млекопитающих, включая эпителий языка и соединительную ткань. Чтобы отделить эпителий от мезенхимы языка мыши E 12.5, перенесите усыпленную беременную самку мыши в хирургическую область и смочите брюшную полость мыши 70% этанолом, чтобы предотвратить попадание меха в место операции.
Откройте брюшную полость с помощью рассекающих ножниц, чтобы обнажить матоточные рога, несущие эмбрионы, рассеките рога матки и перенесите их на 15 миллилитров свежего раствора Тирода в 100-миллиметровой чашке для культивирования. Под рассекающим микроскопом используйте мини-ножницы и тонкие щипцы, чтобы рассекать эмбрионы от рогов матки. Откройте полость рта тонкими щипцами и рассекайте язык от мандиблы с помощью мини-ножниц.
Промыть языки 15 миллилитрами свежего стерильного раствора Тирода в 100-миллиметровой чашке для культивовки. Затем переложите ткани на два миллилитра ферментной смеси диспазы и коллагена в 35-миллиметровую культурную чашку и инкубируют в течение 20 минут при 37 градусах Цельсия. Перенесите языки на 15 миллилитров свежего стерильного раствора Тирода и аккуратно отделите мезенхиму и эпителий с вентральной стороны с помощью тонких щипцов.
Отделенная эпителия и мезенхима промыть дважды в 15 миллилитрах свежего стерильного раствора Тирода. Чтобы отделить эпителий языка от подлежащей соединительной ткани взрослой мыши, перенесите усыпленную мышь в хирургическую область и смочите голову мыши, используя 70% этанол, чтобы предотвратить попадание меха в ротовую полость. Используйте рассекающие ножницы, чтобы срезать уголки рта вдоль щеки, чтобы открыть ротовую полость.
Рассекните язык с помощью мандиблы, вымойте его и поместите в пластиковую посуду со слоем полиэтиленовой пленки. Используя хирургические щипцы для удержания языка, вводят ферментную смесь диспазы и коллагеназы в субэпителиальное пространство языка через режущий край заднего языка. Вводят один миллилитр ферментной смеси равномерно на весь язык для сбора тканей, затем вводят 0,5 миллилитра ферментной смеси локально в передний язык для сбора тканей с кончика языка или на задний язык для циркумвалляционного сбора ткани сосочков.
Оберните язык полиэтиленовой пленкой и высиживая его в течение 30 минут при 37 градусах Цельсия. Используйте мини-ножницы, чтобы рассекать циркумваллатный сосочек и кончик языка. Затем переложить ткань на 15 миллилитров свежего стерильного раствора Тирода.
Отделите эпителий от подлежащей соединительной ткани в ферменте, перевариваемом субэпителиальном пространстве, используя мини-ножницы, и обрежьте ткани до надлежащего размера, в соответствии с требованием последующих экспериментов. Дважды промыть отделенный эпителий и подлежащую соединительную ткань в 15 миллилитрах свежего стерильного раствора Тирода в 100-миллиметровой чашке для культивирование. Переложите ткани на три миллилитра 0,25% трипсина ЭДТА в новой 35-миллиметровой чашке для культивирование.
Инкубируйте блюдо в течение 30 минут при 37 градусах Цельсия, осторожно перемешивая ткани каждые пять минут одним миллилитром наконечников пипетки. Добавьте 500 микролитров 5% FBS в DMEM F12, чтобы остановить реакцию и перенести среду в пятимиллилитровую центрифужную трубку с низким связыванием. Центрифугируют клеточную суспензию в 200 раз G в течение восьми минут при комнатной температуре и удаляют супернатант.
Осторожно повторно суспендируйте клетки в трех миллилитрах DMEM F12, содержащих 10% FBS и 1% BSA, и фильтруйте клетки с помощью 70-микрометрового клеточного сетчатого фильтра, за которым следует 35-микрометровый клеточный сетчатый фильтр. Центрифугируют клеточную суспензию в 200 раз G в течение восьми минут при комнатной температуре, затем удаляют большую часть среды, оставляя от 50 до 300 микролитров в качестве конечного объема для повторного суспендирования клеток. В эмбриональном языке мыши виден разрыв в субэпителиальном пространстве после правильного переваривания ферментов.
На язык взрослой мыши успешная инъекция фермента указывает на отек в вводимых областях, что говорит о том, что фермент может удерживаться языком. После объединения эпителиальных листов языка E12.5 и тонких слоев мезенхимы ручной подсчет клеток показал, что протокол дал 63 917 клеток в общей сложности с жизнеспособностью 95,2% из эпителиальных листов и 294 333 клетки в общей сложности с жизнеспособностью 96,3% из мезенхимы. Когда использовались 10 взрослых языков в возрасте восьми недель, протокол дал 187 333 клетки с жизнеспособностью 95,4% из эпителиальных листов кончика языка, 544 000 клеток с жизнеспособностью 96,3% из эпителиальных листов циркумваллатных сосочков и 150 500 клеток с жизнеспособностью 93% из соединительных тканей.
Следуя этому протоколу, диссоциированные клетки могут быть использованы для секвенирования одноклеточной РНК и 3D-теста органоидной культуры для определения нераспознанных тестовых клеток-прогениторов под лингвальным эпителием.
