복잡한 조직에서 세포의 높은 수율 과 품질은 일반적으로 사용되는 실험 분석에 필수적이다, 단일 세포 RNA 염기서열 분석 및 1 차 줄기 세포 배양과 같은. 이 프로토콜은 혀 상피 및 결합 조직을 포함하여 포유류 혀의 다른 지역 및 조직 구획에서 높은 수율과 품질에 건강한 세포를 생성합니다. E 12.5 마우스 혀의 중간부메에서 상피를 분리하려면 안락사된 임산부 마우스를 수술 부위로 옮기고 마우스 복부를 70%에탄올로 적시어 수술 부위로 들어가는 것을 방지한다.
배아를 운반하는 자궁 뿔을 노출하고 자궁 뿔을 해부하고 100mm 배양 접시에 신선한 티로드의 용액 15 밀리리터로 옮기기 위해 해부 가위를 사용하여 복부를 엽니다. 해부 현미경에서 미니 가위와 미세 한 집게를 사용하여 자궁 뿔에서 배아를 해부하십시오. 미세한 집게로 입 구멍을 열고 미니 가위를 사용하여 하악에서 혀를 해부합니다.
100mm 배양 접시에 신선한 멸균 티로드의 용액 15 밀리리터로 혀를 씻어. 그런 다음 35mm 배양 접시에 디스파스와 콜라주누스의 효소 혼합물의 2 밀리리터로 조직을 전송하고 섭씨 37도에서 20 분 동안 배양합니다. 혀를 신선한 멸균 티로드의 용액 15밀리리터로 옮기고, 미세한 집게를 사용하여 중간과 상피를 복부 측에서 부드럽게 분리합니다.
분리된 상피와 메센키메를 신선한 멸균 티로드용 15밀리리터로 두 번 씻으시다. 혀 상피를 성인 마우스의 기본 결합 조직으로부터 분리하려면 안락사 된 마우스를 수술 부위로 옮기고 70 %에탄올을 사용하여 마우스 머리를 적시어 모피가 구강안으로 들어가는 것을 방지합니다. 해부 가위를 사용하여 뺨을 따라 입의 모서리를 잘라 구강을 엽니다.
혀를 하악한 것으로 해부하고 씻고 플라스틱 랩으로 플라스틱 접시에 놓습니다. 혀를 잡기 위해 외과 용 집게를 사용하여 후방혀의 절삭 날을 통해 혀의 하위 공간에 디스파스와 콜라게나아제의 효소 혼합물을 주입하십시오. 조직 수집을 위해 전체 혀에 효소 혼합물 1 밀리리터를 고르게 주입한 다음, 혀 끝에서 조직 수집을 위해 전방 혀에 국소적으로 효소 혼합물 0.5 밀리리터를 주입하거나 주위 유두 조직 수집을 위한 후면 혀에 주입합니다.
혀를 플라스틱 랩으로 감싸고 섭씨 37도에서 30분 동안 배양합니다. 미니 가위를 사용하여 주위 유두와 혀 팁을 해부하십시오. 그런 다음 조직을 신선한 멸균 티로드용 15 밀리리터로 옮기습니다.
미니 가위를 사용하여 소화된 효소의 기본 결합 조직으로부터 상피를 분리하고 다운스트림 실험의 요구 사항에 따라 조직을 적절한 크기로 다듬습니다. 분리된 상피와 기본 결합 조직을 100mm 배양 접시에 신선한 멸균 티로드의 용액 15 밀리리터로 두 번 씻으시다. 새로운 35 밀리미터 배양 접시에 0.25 %의 트립신 EDTA의 세 밀리리터에 조직을 전송합니다.
37°C에서 30분간 요리를 배양하고, 5분마다 1밀리리터 파이펫 팁으로 조직을 부드럽게 교반합니다. DMEM F12에 5%FBS의 500 마이크로리터를 추가하여 반응을 멈추고 배지를 5밀리리터 저결합 원심분리기로 전송합니다. 실온에서 8분 동안 200배 G의 세포 현탁액을 원심분리하고 상체를 제거합니다.
10%FBS 및 1%BSA를 포함하는 DMEM F12의 3밀리리터에서 세포를 부드럽게 재일시 중단하고, 70 마이크로미터 세포 스트레이너로 세포를 필터링한 다음 35마이크로미터 세포 스트레이너가 뒤따릅니다. 실온에서 8분 동안 200배 G의 세포 현탁액을 원심분리한 다음 대부분의 배지를 제거하여 50~300마이크로리터를 최종 부피로 남겨 세포를 재보습합니다. 배아 마우스 혀에서, 적절한 효소 소화 후 피상적 공간의 간격이 보입니다.
성인 마우스 혀에서, 성공적인 효소 주입은 주입 된 영역에서 붓기에 의해 표시되며, 이는 효소가 혀에 의해 유지 될 수 있음을 시사한다. E12.5 혀의 상피 시트와 메센키메의 얇은 층을 풀링 한 후, 수동 세포 계수는 프로토콜이 상피 시트에서 95.2 %의 생존력을 가진 총 63, 917 세포를 산출하고, 294, 333 세포의 생존력을 가진 총 96.3 %의 생존력을 보였다. 8주에 10명의 성인 혀를 사용했을 때, 프로토콜은 혀 끝의 상피 시트에서 95.4%의 생존력을 가진 187, 333개의 세포를 산출하고, 544, 000세포의 생존율을 가진 세포는 둘레 의 상피 시트에서 96.3%, 그리고 150, 500의 세포가 93%의 생존력을 가진 세포를 산출하였다.
이러한 프로토콜에 따라, 해리된 세포는 언어 상피 하에서 인식되지 않는 시험 전구 세포를 정의하기 위해 단세포 RNA 시퀀싱 및 3D 테스트 오르가노이드 배양에 사용될 수 있다.
