يوفر هذا البروتوكول نهجا قبل السريري لاكتشاف والتحقق من صحة العلاجات الصيدلانية لأمراض الشبكية الأيضية مباشرة داخل أنسجة الشبكية البشرية. تجمع هذه التقنية بين تعقيد عملية التمثيل الغذائي في الأنسجة البشرية مع براعة وإنتاجية زراعة الخلايا. لقد استخدمنا هذا الاختبار للحصول على بيانات ما قبل السريرية لعلاج مرض تنكس الشبكية ، MacTel ، باستخدام دواء شائع وآمن لتغيير الدهون ، fenofibrate ، والذي هو الآن في تجارب السلامة السريرية.
يمكن تطبيق هذا النهج على أي عدد من ضغوط الشبكية الشائعة التي تؤدي إلى المرض بما في ذلك نقص المغذيات ونقص الأكسجة والسمية الضوئية والدهون السامة الأخرى. في الأسبوع 24 من الثقافة ، تحقق من المواد العضوية لتشكيل شرائح بدائية على السطح الخارجي للعضوي. بحلول الأسبوع 26 إلى 28 ، يجب أن تكون الأجزاء الخارجية قد شكلت طبقة سميكة.
عندما يمكن ملاحظة جزء متشكك سميك ، قم بتخفيف محلول مخزون deoxySA واحد بالمليمولار إلى 0.51. واحد واثنين من تركيزات ميكرومولار في ثلاثة ملليلتر من وسط تمايز الشبكية زائد. باستخدام مجهر تشريح ومسبار معقم ، حدد أربع مجموعات من المواد العضوية من نفس الحجم والشكل تقريبا مع ما لا يقل عن خمسة عضويات لكل مجموعة ، وقم بتقسيم المجموعات إلى آبار فردية من صفيحة 6 آبار منخفضة للغاية.
عندما يتم جمع جميع المواد العضوية ، قم بإزالة أكبر قدر ممكن من الوسط من كل بئر وأضف تركيزا واحدا من محلول deoxySA إلى كل بئر. أضف التحكم في السيارة إلى المجموعة الرابعة من المواد العضوية. بعد يومين من المزرعة ، استبدل طاف الاستزراع ب deoxySA الطازج المناسب أو تخفيف التحكم.
بعد أربعة أيام من المزرعة ، قم بتضمين قسم التبريد وصبغ الكائنات العضوية وفقا للبروتوكولات القياسية للسماح بتقييم موت الخلايا داخل كل مزرعة. بعد التلوين ، استخدم تكبيرا من خمسة إلى 10 أضعاف لتحديد منطقة من قسم العضوي المقطع السليم والتكوين الجيد وفي مستوى يأخذ عينات من مقطع عرضي تمثيلي للعضوي. يجب أن يحتوي القسم على طبقة نووية خارجية مميزة من المستقبلات الضوئية التي لا يقل سمكها عن بضع خلايا ، وطبقة منفصلة ومميزة من النوى التي لا تحتوي على تعافي وتلطيخ.
ضع إطارا للصورة وقم بزيادة التكبير إلى 20x. ثم قم بتأطير الشريحة مرة أخرى لملء الصورة بأكبر قدر ممكن من طبقة مستقبلات الضوء. اضبط المستوى Z واضبط الحدود السفلية للطرف العلوي للنطاق Z لتصوير عمق الشريحة بالكامل.
ثم قم بتصوير جميع قنوات الفلوروفور الثلاث في عملية استحواذ على Z-stack ، واحفظ الصورة بتنسيق ملف يحافظ على نسبة المساحة لكل بكسل. لتحديد عدد الخلايا الميتة في كل عينة ، افتح مكدسات الصور في فيجي. في نافذة خيارات استيراد التنسيق الحيوي ، تأكد من عدم تحديد أي مربعات ضمن قسم الانقسام إلى نوافذ منفصلة وحدد مشروع الصورة والمكدسات و Z لإنشاء صورة جديدة للقياس الكمي.
حدد قناة الصورة التي تعرض الاسترداد والتلوين واستخدم أداة تحديد المضلع لتحديد منطقة متصلة من المستقبلات الضوئية في الصورة. انقر فوق تحليل وتعيين القياسات وحدد مربع المنطقة. انقر فوق تحليل وقياس ، لقياس مساحة المستقبلات الضوئية ، لحساب الخلايا المحتضرة.
سيظهر القياس في نافذة منبثقة. لحساب النوى الإيجابية لموت الخلايا المبرمج في منطقة مستقبلات الضوء المحددة ، انقر بزر الماوس الأيمن على أداة النقطة لتحديد الأداة متعددة النقاط وتحديد تلطيخ موت الخلايا المبرمج الإيجابي الذي يتداخل مع نوى DAPI الموجبة والتعافي والتلطيخ. قم بالتبديل بين القنوات للتحقق من صحة الخلايا الإيجابية.
ثم قسم عدد الخلايا الإيجابية لموت الخلايا المبرمج على المنطقة للحصول على قيمة طبيعية لموت الخلايا داخل المستقبلات الضوئية لكل عضوي. بعد تحديد تركيز deoxySA الذي يحفز موت الخلية المستهدفة ، استخدم مسبارا معقما لاختيار ثلاث مجموعات من الكائنات العضوية من نفس الحجم والشكل تقريبا بحد أدنى خمسة عضويات لكل مجموعة. وأضف المجموعات إلى الآبار الفردية للوحة 6 آبار منخفضة للغاية.
أضف تركيز موت الخلية المستهدفة ل deoxySA ، تركيز موت الخلية المستهدفة ل deoxySA المكمل بالدواء محل الاهتمام أو وسيط التحكم إلى البئر أو المواد العضوية المناسبة. بعد يومين ، استبدل المادة الطافية في كل بئر بالتركيز المناسب للمعالجة الطازجة أو وسط التحكم. بعد أربعة أيام من الثقافة ، قم بتقييم الثقافات لموت الخلايا كما هو موضح.
في هذا التحليل التمثيلي ، عولجت عضويات الشبكية المتولدة من خط الخلايا الجذعية متعددة القدرات الناجم عن توسع الشعيرات غير البقعي من النوع 2 بأربعة تركيزات من deoxySA. كان موت الخلايا استجابة ل deoxySA يعتمد على التركيز ويمكن اكتشافه في أقل من 50 deoxySA نانومولار. أدى أعلى تركيز تم اختباره إلى موت قوي للخلايا مع الحفاظ على سلامة العضو العضوي في شبكية العين.
منع العلاج ب 20 ميكرومولار فينوفايبرات السمية التي يسببها deoxySA في مستقبلات الصورة لعضويات الشبكية ، مما قلل بشكل كبير من موت الخلايا بنسبة 80٪ تقريبا بعد أربعة أيام من العلاج. تذكر أن تختار عضويات جيدة التكوين وصحية لضمان إجراء الفحص في خلايا الشبكية. يمكن معالجة المواد العضوية لجمع الحمض النووي الريبي لتحديد التعبير الجيني ، مما يسمح بتقييم إشارات الإجهاد والتحقق من الآثار السامة وعمليات الإنقاذ.
باستخدام هذه التقنية ، تمكنا من فحص التمثيل الغذائي النهائي للعديد من الدهون المختلفة في المواد العضوية ، مما فتح دراسة استقلاب الدهون في شبكية العين البشرية.
