Este protocolo fornece uma abordagem pré-clínica para descobrir e validar tratamentos farmacêuticos para as doenças metabólicas da retina diretamente no tecido retiniano humano. Esta técnica combina a complexidade do metabolismo em tecidos humanos com a versatilidade e rendimento da cultura celular. Usamos este ensaio para obter dados pré-clínicos para o tratamento da doença degenerativa da retina, MacTel, usando uma droga comum e segura que altera os lipídios, o fenofibrato, que está agora em ensaios clínicos de segurança.
Essa abordagem pode ser aplicada a qualquer número de estressores comuns da retina que levam a doenças, incluindo deficiência de nutrientes, hipóxia, toxicidade por luz e outros lipídios tóxicos. Na semana 24 de cultura, verifique os organoides para a formação de segmentos rudimentares na parte externa do organoide. Na semana 26 a 28, os segmentos externos devem ter formado uma camada espessa.
Quando for possível observar um segmento duvidoso espessado, diluir uma solução-estoque milimolar de desoxiSA para 0,51. Concentrações de um e dois micromolares em três mililitros de meio de diferenciação retiniana plus. Usando um microscópio de dissecção e uma sonda estéril, selecione quatro grupos de organoides de aproximadamente o mesmo tamanho e forma, com um mínimo de cinco organoides por grupo, e divida os grupos em poços individuais de uma placa de 6 poços de fixação ultrabaixa.
Quando todos os organoides tiverem sido coletados, remova o máximo possível de meio de cada poço e adicione uma concentração da solução de deoxySA a cada poço. Adicione o controle do veículo ao quarto grupo de organoides. Após dois dias de cultivo, substituir os sobrenadantes da cultura pelo desoxiSA fresco apropriado ou diluição controle.
Após quatro dias de cultura, incorporar criosecção e corar os organoides de acordo com protocolos padronizados para permitir a avaliação da morte celular dentro de cada cultura. Após a coloração, use um aumento de cinco a 10x para localizar uma região do corte organoide fatiada que esteja intacta, bem formada e em um plano que apareça uma seção transversal representativa do organoide. A seção deve ter uma camada nuclear externa distinta de fotorreceptores que tenha pelo menos algumas células de espessura, e uma camada separada e distinta de núcleos que não tenham recuperação e coloração.
Enquadre a imagem e aumente a ampliação para 20x. Em seguida, enquadre o slide novamente para preencher a imagem com o máximo possível da camada fotorreceptora. Defina o plano Z e defina os limites inferiores superiores do intervalo Z para obter uma imagem de toda a profundidade da fatia.
Em seguida, crie imagens de todos os três canais de fluoróforo em uma aquisição de pilha Z e salve a imagem em um formato de arquivo que preserve a proporção de área por pixel. Para quantificar o número de células mortas em cada amostra, abra as pilhas de imagens em Fiji. Na janela de opções de importação do formato bio, confirme se nenhuma caixa na seção dividir em janelas separadas está marcada e selecione Imagem, Pilhas e Projeto Z para criar uma nova imagem para quantificação.
Selecione o canal de imagem que mostra a recuperação e coloração e use a ferramenta de seleção de polígonos para delinear uma região contínua de fotorreceptores na imagem. Clique em Analisar e definir medidas e selecione a caixa Área. Clique em Analisar e Medir, para medir a área dos fotorreceptores, para contar as células moribundas.
A medida aparecerá em uma janela pop-up. Para contar os núcleos positivos para apoptose na região fotorreceptora selecionada, clique com o botão direito do mouse na ferramenta de ponto para selecionar a ferramenta multiponto e selecione a coloração positiva de apoptose que se sobrepõe a um núcleo positivo para DAPI e se recupera e colore. Alterne entre os canais para validar as células positivas.
Em seguida, divida o número de células positivas para apoptose pela área para obter um valor normalizado para a morte celular dentro dos fotorreceptores por organoide. Depois de determinar a concentração de desoxiSA que induz a morte celular alvo, use uma sonda estéril para selecionar três grupos de organoides de aproximadamente o mesmo tamanho e forma, com um mínimo de cinco organoides por grupo. E adicione os grupos a poços individuais de uma placa de 6 poços de fixação ultrabaixa.
Adicione a concentração de morte celular alvo de deoxySA, a concentração de morte celular alvo de deoxySA suplementada com a droga de interesse ou o meio de controle ao poço ou organoides apropriados. Após dois dias, substituir o sobrenadante em cada poço pela concentração adequada de tratamento a fresco ou meio controle. Após quatro dias de cultura, avaliar as culturas quanto à morte celular demonstrada.
Nesta análise representativa, organoides da retina gerados a partir de uma linhagem de células-tronco pluripotentes induzidas por telangiectasias não maculares tipo 2 foram tratados com quatro concentrações de deoxySA. A morte celular em resposta à desoxiSA foi dependente da concentração e detectável em até 50 nanomolares de desoxiSA. A maior concentração testada induziu uma morte celular robusta, mantendo a integridade do organoide da retina.
O tratamento com fenofibrato 20 micromolares preveniu a toxicidade induzida pelo desoxiSA nos fotorreceptores dos organoides da retina, reduzindo significativamente a morte celular em aproximadamente 80% após quatro dias de tratamento. Lembre-se de selecionar organoides bem formados e saudáveis para garantir que o ensaio esteja sendo realizado nas células da retina. Os organoides podem ser processados para coleta de RNA para quantificar a expressão gênica, permitindo a avaliação de sinais de estresse e a validação de efeitos tóxicos e resgates.
Usando esta técnica, pudemos testar o metabolismo a jusante de múltiplos lipídios diferentes em organoides, abrindo o estudo do metabolismo lipídico em retinas humanas.
