이 프로토콜은 인간 망막 조직 내에서 직접 대사성 망막 질환에 대한 약물 치료법을 발견하고 검증하기 위한 전임상 접근 방식을 제공합니다. 이 기술은 인간 조직의 신진대사의 복잡성과 세포 배양의 다양성 및 처리량을 결합합니다. 우리는 이 분석을 사용하여 현재 임상 안전성 시험 중인 일반적이고 안전한 지질 변경 약물인 페노피브레이트를 사용하여 망막 퇴행성 질환인 MacTel의 치료를 위한 전임상 데이터를 수집했습니다.
이 접근법은 영양 결핍, 저산소증, 빛 독성 및 기타 독성 지질을 포함하여 질병을 유발하는 여러 가지 일반적인 망막 스트레스 요인에 적용할 수 있습니다. 배양 24주차에 오가노이드 외부에 기초 분절이 형성되는지 확인합니다. 26 주에서 28 주까지, 바깥 쪽 세그먼트는 두꺼운 층을 형성해야합니다.
두꺼워진 의심자 세그먼트가 관찰될 수 있을 때, 1밀리몰 데옥시SA 원액을 0.51로 희석한다. 3 밀리리터의 망막 분화 배지 플러스에서 1 및 2 마이크로 몰 농도. 해부 현미경과 멸균 프로브를 사용하여 그룹당 최소 5개의 오가노이드로 크기와 모양이 거의 동일한 4개의 오가노이드 그룹을 선택하고 그룹을 초저 부착 6웰 플레이트의 개별 웰로 분할합니다.
모든 오가노이드가 수집되면 각 웰에서 가능한 한 많은 배지를 제거하고 각 웰에 한 농도의 deoxySA 용액을 추가합니다. 비히클 대조군을 오가노이드의 네 번째 그룹에 추가합니다. 2일간의 배양 후, 배양 상청액을 적절한 신선한 deoxySA 또는 대조 희석액으로 교체합니다.
4일간의 배양 후 각 배양 내 세포 사멸을 평가할 수 있도록 표준 프로토콜에 따라 저온 절편을 삽입하고 오가노이드를 염색합니다. 염색 후, 5 - 10x 배율을 사용하여 손상되지 않고 잘 형성된 슬라이스된 오가노이드 섹션의 영역을 오가노이드의 대표 단면을 샘플링하는 평면에서 찾습니다. 이 절편에는 적어도 몇 개의 세포 두께의 광수용체의 뚜렷한 외부 핵층과 회복 및 염색이 없는 분리되고 뚜렷한 핵층이 있어야 합니다.
이미지의 구도를 잡고 배율을 20배로 늘립니다. 그런 다음 슬라이드의 구도를 다시 잡아 이미지를 가능한 한 많은 광수용체 층으로 채웁니다. Z 평면을 설정하고 Z 범위의 상한 하한을 설정하여 슬라이스의 전체 깊이를 이미지화합니다.
그런 다음 Z 스택 획득에서 형광단의 3개 채널을 모두 이미징하고 픽셀당 면적 비율을 유지하는 파일 형식으로 이미지를 저장합니다. 각 샘플에서 죽은 세포의 수를 정량화하려면 피지에서 이미지 스택을 엽니다. 바이오 형식의 가져오기 옵션 창에서 별도의 창으로 분할 섹션 아래의 상자가 선택되어 있지 않은지 확인하고 이미지, 스택 및 Z 프로젝트를 선택하여 정량화를 위한 새 이미지를 만듭니다.
복구 및 염색을 보여주는 이미지 채널을 선택하고 다각형 선택 도구를 사용하여 이미지에서 광수용체의 연속 영역을 윤곽을 그립니다. 측정 분석 및 설정을 클릭하고 영역 상자를 선택합니다. Analyze and Measure(분석 및 측정)를 클릭하여 광수용체의 면적을 측정하고 죽어가는 세포의 수를 계산합니다.
측정값이 팝업 창에 나타납니다. 선택한 광수용체 영역에서 세포자멸사 양성 핵을 계산하려면 점 도구를 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하여 다점 도구를 선택하고 DAPI 양성 핵과 겹치는 세포자멸사 양성 염색을 선택하고 복구 및 염색합니다. 채널 사이를 전환하여 양성 셀의 유효성을 검사합니다.
그 후 세포사멸 양성 세포의 수를 면적별로 나누어 오가노이드 당 광수용체 내 세포 사멸에 대한 정규화된 값을 구한다. 표적 세포 사멸을 유도하는 deoxySA 농도를 결정한 후 멸균 프로브를 사용하여 그룹당 최소 5개의 오가노이드로 거의 동일한 크기와 모양의 오가노이드 3개 그룹을 선택합니다. 그리고 그룹을 초저 부착 6-웰 플레이트의 개별 웰에 추가합니다.
관심 약물 또는 대조 배지로 보충된 deoxySA의 표적 세포사 농도, 표적 세포사 농도인 deoxySA를 적절한 웰 또는 오가노이드에 추가합니다. 2일 후, 각 웰 내의 상청액을 적절한 농도의 새로운 처리 또는 대조 배지로 교체한다. 4일간의 배양 후, 입증된 바와 같이 세포 사멸에 대한 배양물을 평가합니다.
이러한 대표적인 분석에서, 비황반 모세혈관확장증 제2형 대조군 유도만능줄기세포주로부터 생성된 망막 오가노이드를 4가지 농도의 deoxySA로 처리하였다. deoxySA에 대한 반응으로 세포 사멸은 농도 의존적이었고 50나노몰 deoxySA에서 검출할 수 있었습니다. 테스트된 최고 농도는 망막 오가노이드의 무결성을 유지하면서 강력한 세포 사멸을 유도했습니다.
20마이크로몰 페노피브레이트로 처리하면 망막 오가노이드의 광수용체에서 deoxySA 유도 독성이 방지되어 치료 4일 후 세포 사멸이 약 80% 감소했습니다. 망막 세포에서 분석이 수행되고 있는지 확인하기 위해 잘 형성되고 건강한 오가노이드를 선택하는 것을 잊지 마십시오. 오가노이드는 RNA 수집을 위해 처리되어 유전자 발현을 정량화할 수 있으므로 스트레스 신호를 평가하고 독성 효과 및 구조를 검증할 수 있습니다.
이 기술을 사용하여 우리는 오가노이드에서 여러 다른 지질의 다운스트림 대사를 분석할 수 있었고, 인간 망막의 지질 대사에 대한 연구를 시작할 수 있었습니다.
