Questo protocollo fornisce un approccio preclinico per scoprire e convalidare trattamenti farmaceutici per le malattie metaboliche della retina direttamente all'interno del tessuto retinico umano. Questa tecnica combina la complessità del metabolismo nei tessuti umani con la versatilità e la produttività della coltura cellulare. Abbiamo utilizzato questo test per acquisire dati preclinici per il trattamento della malattia degenerativa retinica, MacTel, utilizzando un farmaco che altera i lipidi comune e sicuro, il fenofibrato, che è ora in studi clinici di sicurezza.
Questo approccio può essere applicato a qualsiasi numero di fattori di stress retinici comuni che portano a malattie tra cui carenza di nutrienti, ipossia, tossicità leggera e altri lipidi tossici. Alla settimana 24 di coltura, controllare gli organoidi per la formazione di segmenti rudimentali all'esterno dell'organoide. Entro la settimana 26-28, i segmenti esterni dovrebbero aver formato uno spesso strato.
Quando si può osservare un segmento di dubbioso ispessito, diluire una soluzione madre di deossiSA millimolare a 0,51. Una e due concentrazioni micromolari in tre millilitri di differenziazione retinica mezzo più. Utilizzando un microscopio a dissezione e una sonda sterile, selezionare quattro gruppi di organoidi di circa le stesse dimensioni e forma con un minimo di cinque organoidi per gruppo e dividere i gruppi in singoli pozzetti di una piastra a 6 pozzetti a attacco ultra-basso.
Quando tutti gli organoidi sono stati raccolti, rimuovere quanto più mezzo possibile da ciascun pozzetto e aggiungere una concentrazione della soluzione di deossiSA a ciascun pozzetto. Aggiungere il controllo del veicolo al quarto gruppo di organoidi. Dopo due giorni di coltura, sostituire i surnatanti di coltura con il deossiSA fresco appropriato o la diluizione di controllo.
Dopo quattro giorni di coltura, incorporare la sezione criogenica e colorare gli organoidi secondo protocolli standard per consentire la valutazione della morte cellulare all'interno di ciascuna coltura. Dopo la colorazione, utilizzare un ingrandimento da cinque a 10x per individuare una regione della sezione organoide affettata che sia intatta, ben formata e in un piano che campiona una sezione trasversale rappresentativa dell'organoide. La sezione dovrebbe avere uno strato nucleare esterno distinto di fotorecettori che sia almeno un paio di cellule spesse e uno strato separato e distinto di nuclei che non hanno recupero e colorazione.
Incorniciare l'immagine e aumentare l'ingrandimento a 20x. Quindi, inquadrare nuovamente la diapositiva per riempire l'immagine con il maggior numero possibile di strati fotorecettori. Impostate il piano Z e impostate i limiti inferiori superiori dell'intervallo Z per visualizzare l'intera profondità della sezione.
Quindi immagina tutti e tre i canali del fluoroforo in un'acquisizione Z-stack e salva l'immagine in un formato di file che preservi il rapporto di area per pixel. Per quantificare il numero di cellule morte in ciascun campione, apri le pile di immagini nelle Figi. Nella finestra delle opzioni di importazione del formato bio, verificare che non siano selezionate caselle nella sezione suddivisione in finestre separate e selezionare Progetto immagine, Pile e Z per creare una nuova immagine per la quantificazione.
Selezionare il canale dell'immagine che mostra il recupero e la colorazione e utilizzare lo strumento di selezione del poligono per delineare una regione continua di fotorecettori nell'immagine. Fare clic su Analizza e imposta misurazioni e selezionare la casella Area. Fare clic su Analizza e misura, per misurare l'area dei fotorecettori, per contare le cellule morenti.
La misurazione apparirà in una finestra pop-up. Per contare i nuclei positivi all'apoptosi nella regione fotorecettore selezionata, fare clic con il pulsante destro del mouse sullo strumento punto per selezionare lo strumento multipunto e selezionare la colorazione positiva dell'apoptosi che si sovrappone a un nucleo positivo DAPI e recuperare e colorare. Passare da un canale all'altro per convalidare le celle positive.
Quindi dividere il numero di cellule positive all'apoptosi per l'area per ottenere un valore normalizzato per la morte cellulare all'interno dei fotorecettori per organoide. Dopo aver determinato la concentrazione di deossiSA che induce la morte delle cellule bersaglio, utilizzare una sonda sterile per selezionare tre gruppi di organoidi di circa le stesse dimensioni e forma con un minimo di cinque organoidi per gruppo. E aggiungi i gruppi ai singoli pozzetti di una piastra a 6 pozzetti ultra-bassa.
Aggiungere la concentrazione di morte delle cellule bersaglio di deoxySA, la concentrazione di morte delle cellule bersaglio di deossiSA integrata con il farmaco di interesse o il mezzo di controllo al pozzo o agli organoidi appropriati. Dopo due giorni, sostituire il surnatante in ciascun pozzetto con la concentrazione appropriata di trattamento fresco o mezzo di controllo. Dopo quattro giorni di coltura, valutare le colture per la morte cellulare come dimostrato.
In questa analisi rappresentativa, organoidi retinici generati da una linea di cellule staminali pluripotenti indotte da controllo non maculare telangiectasia di tipo 2 sono stati trattati con quattro concentrazioni di deossiSA. La morte cellulare in risposta al deossiSA era dipendente dalla concentrazione e rilevabile in appena 50 nanomolari deossiSA. La più alta concentrazione testata ha indotto una robusta morte cellulare pur mantenendo l'integrità dell'organoide retinico.
Il trattamento con fenofibrato micromolare 20 ha impedito la tossicità indotta da deossiSA nei fotorecettori degli organoidi retinici, riducendo significativamente la morte cellulare di circa l'80% dopo quattro giorni di trattamento. Ricordarsi di selezionare organoidi ben formati e sani per garantire che il test venga eseguito nelle cellule retiniche. Gli organoidi possono essere elaborati per la raccolta dell'RNA per quantificare l'espressione genica, consentendo la valutazione dei segnali di stress e la convalida di effetti tossici e salvataggi.
Utilizzando questa tecnica, siamo stati in grado di saggiare il metabolismo a valle di più lipidi diversi negli organoidi, aprendo lo studio del metabolismo lipidico nelle retine umane.
