Dieses Protokoll bietet einen präklinischen Ansatz zur Entdeckung und Validierung pharmazeutischer Behandlungen für metabolische Netzhauterkrankungen direkt im menschlichen Netzhautgewebe. Diese Technik kombiniert die Komplexität des Stoffwechsels in menschlichem Gewebe mit der Vielseitigkeit und dem Durchsatz von Zellkulturen. Wir haben diesen Assay verwendet, um präklinische Daten für die Behandlung der degenerativen Netzhauterkrankung MacTel unter Verwendung eines gängigen und sicheren lipidverändernden Medikaments, Fenofibrat, zu erhalten, das sich derzeit in klinischen Sicherheitsstudien befindet.
Dieser Ansatz kann auf eine beliebige Anzahl von häufigen retinalen Stressoren angewendet werden, die zu Krankheiten führen, einschließlich Nährstoffmangel, Hypoxie, Lichttoxizität und anderen toxischen Lipiden. Überprüfen Sie in der 24. Kulturwoche die Organoide auf die Bildung rudimentärer Segmente an der Außenseite des Organoids. In den Wochen 26 bis 28 sollten die äußeren Segmente eine dicke Schicht gebildet haben.
Wenn ein verdicktes Zweiflersegment beobachtet werden kann, verdünnen Sie eine millimolare DesoxySA-Stammlösung auf 0,51. Ein- und zwei mikromolare Konzentrationen in drei Millilitern retinalem Differenzierungsmedium plus. Wählen Sie mit einem Dissektionsmikroskop und einer sterilen Sonde vier Gruppen von Organoiden von ungefähr gleicher Größe und Form mit mindestens fünf Organoiden pro Gruppe aus und teilen Sie die Gruppen in einzelne Vertiefungen einer 6-Well-Platte mit extrem niedriger Befestigung auf.
Wenn alle Organoide gesammelt wurden, entfernen Sie so viel Medium wie möglich aus jeder Vertiefung und geben Sie eine Konzentration der DesoxySA-Lösung in jede Vertiefung. Fügen Sie die Fahrzeugkontrolle zur vierten Gruppe von Organoiden hinzu. Ersetzen Sie nach zwei Tagen Kultur die Kulturüberstände durch die entsprechende frische DesoxySA- oder Kontrollverdünnung.
Nach viertägiger Kultur wird der Kryoschnitt eingebettet und die Organoide gemäß den Standardprotokollen gefärbt, um die Beurteilung des Zelltods in jeder Kultur zu ermöglichen. Verwenden Sie nach dem Färben eine fünf- bis 10-fache Vergrößerung, um einen Bereich des geschnittenen Organoidabschnitts zu lokalisieren, der intakt, gut geformt und in einer Ebene ist, die einen repräsentativen Querschnitt des Organoids abtastet. Der Abschnitt sollte eine ausgeprägte äußere Kernschicht von Photorezeptoren aufweisen, die mindestens einige Zellen dick ist, und eine separate und deutliche Schicht von Kernen, die keine Erholung und Färbung aufweisen.
Rahmen Sie das Bild ein und erhöhen Sie die Vergrößerung auf das 20-fache. Gestalten Sie dann die Folie erneut, um das Bild mit so viel wie möglich von der Photorezeptorschicht zu füllen. Legen Sie die Z-Ebene fest und legen Sie die oberen unteren Grenzen des Z-Bereichs fest, um die gesamte Tiefe des Slices abzubilden.
Stellen Sie dann alle drei Kanäle des Fluorophors in einer Z-Stapel-Aufnahme dar und speichern Sie das Bild in einem Dateiformat, das das Verhältnis der Fläche pro Pixel beibehält. Um die Anzahl der toten Zellen in jeder Probe zu quantifizieren, öffnen Sie die Bildstapel in Fidschi. Vergewissern Sie sich im Fenster mit den Importoptionen des Bio-Formats, dass keine Kontrollkästchen unter dem Abschnitt "In separate Fenster aufteilen" aktiviert sind, und wählen Sie "Bild", "Stapel" und "Z-Projekt" aus, um ein neues Bild für die Quantifizierung zu erstellen.
Wählen Sie den Bildkanal aus, der die Wiederherstellung und Färbung anzeigt, und verwenden Sie das Polygonauswahlwerkzeug, um einen kontinuierlichen Bereich von Photorezeptoren im Bild zu skizzieren. Klicken Sie auf Analysieren und Festlegen von Messungen, und aktivieren Sie das Kontrollkästchen Bereich. Klicken Sie auf Analysieren und Messen, um die Fläche der Photorezeptoren zu messen und die sterbenden Zellen zu zählen.
Die Messung wird in einem Popup-Fenster angezeigt. Um die Apoptose-positiven Kerne in der ausgewählten Photorezeptorregion zu zählen, klicken Sie mit der rechten Maustaste auf das Punktwerkzeug, um das Mehrpunktwerkzeug auszuwählen, und wählen Sie die Apoptose-positive Färbung aus, die sich mit einem DAPI-positiven Kern überlappt, und erholen und färben. Wechseln Sie zwischen den Kanälen, um die positiven Zellen zu validieren.
Teilen Sie dann die Anzahl der Apoptose-positiven Zellen durch die Fläche, um einen normalisierten Wert für den Zelltod innerhalb der Photorezeptoren pro Organoid zu erhalten. Nachdem Sie die DesoxySA-Konzentration bestimmt haben, die den Zielzelltod induziert, verwenden Sie eine sterile Sonde, um drei Gruppen von Organoiden von ungefähr gleicher Größe und Form mit mindestens fünf Organoiden pro Gruppe auszuwählen. Und fügen Sie die Gruppen zu einzelnen Vertiefungen einer 6-Well-Platte mit extrem niedrigem Aufsatz hinzu.
Fügen Sie die Zielzelltodkonzentration von DesoxySA, die Zielzelltodkonzentration von DesoxySA, ergänzt mit dem interessierenden Arzneimittel oder dem Kontrollmedium, in die entsprechende Vertiefung oder Organoide hinzu. Ersetzen Sie nach zwei Tagen den Überstand in jeder Vertiefung durch die entsprechende Konzentration an frischem Behandlungs- oder Kontrollmedium. Beurteilen Sie nach vier Tagen Kultur die Kulturen wie gezeigt auf Zelltod.
In dieser repräsentativen Analyse wurden retinale Organoide, die aus einer nicht-makulären Teleangiektasie-Typ-2-Kontroll-induzierten pluripotenten Stammzelllinie generiert wurden, mit vier Konzentrationen von DesoxySA behandelt. Der Zelltod als Reaktion auf DesoxySA war konzentrationsabhängig und in nur 50 nanomolaren DesoxySA nachweisbar. Die höchste getestete Konzentration induzierte einen robusten Zelltod, während die Integrität des Netzhautorganoids erhalten blieb.
Die Behandlung mit 20 mikromolaren Fenofibrat verhinderte die DeoxySA-induzierte Toxizität in den Photorezeptoren von Netzhautorganoiden und reduzierte den Zelltod nach viertägiger Behandlung signifikant um etwa 80%. Denken Sie daran, gut geformte und gesunde Organoide auszuwählen, um sicherzustellen, dass der Assay in Netzhautzellen durchgeführt wird. Die Organoide können für die RNA-Sammlung verarbeitet werden, um die Genexpression zu quantifizieren, was die Bewertung von Stresssignalen und die Validierung toxischer Wirkungen und Rettungen ermöglicht.
Mit dieser Technik konnten wir den nachgeschalteten Stoffwechsel mehrerer verschiedener Lipide in Organoiden untersuchen und so die Untersuchung des Fettstoffwechsels in der menschlichen Netzhaut eröffnen.
