Ce protocole fournit une approche préclinique pour découvrir et valider des traitements pharmaceutiques pour les maladies métaboliques de la rétine directement dans le tissu rétinien humain. Cette technique combine la complexité du métabolisme dans les tissus humains avec la polyvalence et le débit de la culture cellulaire. Nous avons utilisé ce test pour acquérir des données précliniques pour le traitement de la maladie dégénérative rétinienne, MacTel, en utilisant un médicament modifiant les lipides commun et sûr, le fénofibrate, qui fait actuellement l’objet d’essais cliniques d’innocuité.
Cette approche peut être appliquée à un certain nombre de facteurs de stress rétiniens courants qui conduisent à la maladie, y compris la carence en nutriments, l’hypoxie, la toxicité de la lumière et d’autres lipides toxiques. À la semaine 24 de culture, vérifier la formation de segments rudimentaires sur les organoïdes sur les organoïdes. À la semaine 26 à 28, les segments extérieurs devraient avoir formé une couche épaisse.
Lorsqu’un segment sceptique épaissi peut être observé, diluer une solution mère de désoxySA millimolaire à 0,51. Concentrations micromolaires d’un et deux micromolaires dans trois millilitres de milieu de différenciation rétinienne plus. À l’aide d’un microscope à dissection et d’une sonde stérile, sélectionner quatre groupes d’organoïdes de taille et de forme approximativement identiques avec un minimum de cinq organoïdes par groupe, et diviser les groupes en puits individuels d’une plaque à 6 puits à très faible attache.
Lorsque tous les organoïdes ont été recueillis, retirer autant de milieu que possible de chaque puits et ajouter une concentration de la solution de désoxySA à chaque puits. Ajouter la commande du véhicule au quatrième groupe d’organoïdes. Après deux jours de culture, remplacer les surnageants de culture par la dilution de désoxySA fraîche ou de contrôle appropriée.
Après quatre jours de culture, intégrer la section cryogénique et colorer les organoïdes selon les protocoles standard pour permettre l’évaluation de la mort cellulaire dans chaque culture. Après coloration, utilisez un grossissement de cinq à 10x pour localiser une région de la section organoïde tranchée qui est intacte, bien formée et dans un plan qui échantillonne une section efficace représentative de l’organoïde. La section devrait avoir une couche nucléaire externe distincte de photorécepteurs d’au moins quelques cellules d’épaisseur, et une couche séparée et distincte de noyaux qui n’ont pas de récupération et de coloration.
Cadrez l’image et augmentez l’agrandissement à 20x. Ensuite, cadrez à nouveau la diapositive pour remplir l’image avec autant de couche photoréceptrice que possible. Définissez le plan Z et définissez les limites inférieures supérieures de la plage Z pour imager toute la profondeur de la tranche.
Ensuite, imagez les trois canaux de fluorophore dans une acquisition Z-stack et enregistrez l’image dans un format de fichier qui préserve le rapport de surface par pixel. Pour quantifier le nombre de cellules mortes dans chaque échantillon, ouvrez les piles d’images aux Fidji. Dans la fenêtre des options d’importation du format bio, vérifiez qu’aucune case sous la section Diviser en fenêtres distinctes n’est cochée et sélectionnez Projet Image, Piles et Z pour créer une nouvelle image à quantifier.
Sélectionnez le canal d’image qui montre la récupération et la coloration et utilisez l’outil de sélection de polygones pour définir une région continue de photorécepteurs dans l’image. Cliquez sur Analyser et définir les mesures, puis cochez la case Zone. Cliquez sur Analyser et mesurer pour mesurer la surface des photorécepteurs et compter les cellules mourantes.
La mesure apparaîtra dans une fenêtre pop-up. Pour compter les noyaux positifs à l’apoptose dans la région photoréceptrice sélectionnée, cliquez avec le bouton droit de la souris sur l’outil point pour sélectionner l’outil multipoint et sélectionner la coloration positive à l’apoptose qui chevauche un noyau positif DAPI et récupérer et colorer. Basculez entre les canaux pour valider les cellules positives.
Divisez ensuite le nombre de cellules apoptoses positives par la zone pour obtenir une valeur normalisée de la mort cellulaire dans les photorécepteurs par organoïde. Après avoir déterminé la concentration de deoxySA qui induit la mort cellulaire cible, utilisez une sonde stérile pour sélectionner trois groupes d’organoïdes de taille et de forme approximativement identiques avec un minimum de cinq organoïdes par groupe. Et ajoutez les groupes aux puits individuels d’une plaque de 6 puits à attachement ultra-bas.
Ajouter la concentration de mort cellulaire cible de la désoxySA, la concentration de mort cellulaire cible de la désoxySA complétée par le médicament d’intérêt ou le milieu témoin au puits ou aux organoïdes appropriés. Après deux jours, remplacer le surnageant dans chaque puits par la concentration appropriée de traitement frais ou de milieu témoin. Après quatre jours de culture, évaluer les cultures pour la mort cellulaire comme démontré.
Dans cette analyse représentative, des organoïdes rétiniens générés à partir d’une lignée de cellules souches pluripotentes induites par télangiectasie non maculaire de type 2 ont été traités avec quatre concentrations de deoxySA. La mort cellulaire en réponse à la désoxySA dépendait de la concentration et était détectable dans aussi peu que 50 nanomolaires de désoxySA. La concentration la plus élevée testée a induit une mort cellulaire robuste tout en maintenant l’intégrité de l’organoïde rétinien.
Le traitement par 20 micromolaires fénofibrate a empêché la toxicité induite par la désoxySA dans les photorécepteurs des organoïdes rétiniens, réduisant considérablement la mort cellulaire d’environ 80% après quatre jours de traitement. N’oubliez pas de sélectionner des organoïdes bien formés et sains pour vous assurer que le test est effectué dans les cellules rétiniennes. Les organoïdes peuvent être traités pour la collecte d’ARN afin de quantifier l’expression des gènes, ce qui permet l’évaluation des signaux de stress et la validation des effets toxiques et des sauvetages.
En utilisant cette technique, nous avons pu tester le métabolisme en aval de plusieurs lipides différents dans les organoïdes, ouvrant ainsi l’étude du métabolisme des lipides dans les rétines humaines.
