Bu protokol, metabolik retina hastalıkları için farmasötik tedavilerin doğrudan insan retina dokusu içinde keşfedilmesi ve doğrulanması için klinik öncesi bir yaklaşım sağlar. Bu teknik, insan dokularındaki metabolizmanın karmaşıklığını, hücre kültürünün çok yönlülüğü ve verimi ile birleştirir. Bu tahlili, retinal dejeneratif hastalık MacTel'in tedavisi için klinik öncesi verileri elde etmek için, şu anda klinik güvenlik denemelerinde olan yaygın ve güvenli bir lipit değiştirici ilaç olan fenofibrat kullanarak kullandık.
Bu yaklaşım, besin eksikliği, hipoksi, ışık toksisitesi ve diğer toksik lipitler dahil olmak üzere hastalığa yol açan herhangi bir sayıda yaygın retinal stresöre uygulanabilir. Kültürün 24. haftasında, organoidlerin dışında ilkel segmentlerin oluşumu için organoidleri kontrol edin. 26 ila 28. haftalarda, dış segmentler kalın bir tabaka oluşturmuş olmalıdır.
Kalınlaşmış bir şüpheci segment gözlendiğinde, bir milimolar deoksiSA stok çözeltisini 0.51'e seyreltin. Üç mililitre retina farklılaşma ortamında artı bir ve iki mikromolar konsantrasyon. Bir diseksiyon mikroskobu ve steril bir prob kullanarak, grup başına en az beş organoid ile yaklaşık olarak aynı boyut ve şekle sahip dört organoid grubu seçin ve grupları ultra düşük bir ataşman 6 delikli plakanın bireysel kuyucuklarına bölün.
Tüm organoidler toplandığında, her bir kuyucuktan mümkün olduğunca fazla ortam çıkarın ve her bir kuyucuğa bir konsantrasyon deoksiSA çözeltisi ekleyin. Araç kontrolünü dördüncü organoid grubuna ekleyin. İki günlük kültürden sonra, kültür süpernatantlarını uygun taze deoksiSA ile değiştirin veya seyreltmeyi kontrol edin.
Dört günlük kültürden sonra, kriyo kesiti yerleştirin ve her kültürdeki hücre ölümünün değerlendirilmesine izin vermek için organoidleri standart protokollere göre boyayın. Boyama işleminden sonra, dilimlenmiş organoid bölümün sağlam, iyi biçimlendirilmiş ve organoidin temsili bir kesitini örnekleyen bir düzlemde bulunan bir bölgesini bulmak için beş ila 10x büyütme kullanın. Bölüm, en az birkaç hücre kalınlığında ayrı bir dış nükleer fotoreseptör tabakasına ve iyileşme ve lekelenmeye sahip olmayan ayrı ve farklı bir çekirdek tabakasına sahip olmalıdır.
Görüntüyü çerçeveleyin ve büyütmeyi 20x'e yükseltin. Ardından, görüntüyü fotoreseptör katmanının mümkün olduğunca fazlasıyla doldurmak için slaytı tekrar çerçeveleyin. Z düzlemini ayarlayın ve dilimin tüm derinliğini görüntülemek için Z aralığının üst uç alt sınırlarını ayarlayın.
Ardından, üç florofor kanalını da bir Z-yığını ediniminde görüntüleyin ve görüntüyü piksel başına alan oranını koruyan bir dosya biçiminde kaydedin. Her örnekteki ölü hücrelerin sayısını ölçmek için Fiji'deki görüntü yığınlarını açın. Bio formatının içe aktarma seçenekleri penceresinde, ayrı pencerelere bölme bölümünün altındaki hiçbir kutunun işaretli olmadığını onaylayın ve niceleme için yeni bir görüntü oluşturmak üzere Görüntü, Yığınlar ve Z projesi'ni seçin.
Kurtarma ve boyamayı gösteren görüntü kanalını seçin ve görüntüdeki fotoreseptörlerin sürekli bir bölgesini ana hatlarıyla belirtmek için çokgen seçim aracını kullanın. Analyze and Set Measurements (Ölçümleri Analiz Et ve Ayarla) seçeneğini tıklatın ve Area (Alan) kutusunu seçin. Fotoreseptörlerin alanını ölçmek, ölmekte olan hücreleri saymak için Analiz Et ve Ölç'e tıklayın.
Ölçüm bir açılır pencerede görünür. Seçilen fotoreseptör bölgesindeki apoptoz pozitif çekirdekleri saymak için, çok noktalı aracı seçmek üzere nokta aracına sağ tıklayın ve bir DAPI pozitif çekirdeği ile örtüşen apoptoz pozitif boyamayı seçin ve toparlayın ve boyayın. Pozitif hücreleri doğrulamak için kanallar arasında geçiş yapın.
Daha sonra, organoid başına fotoreseptörler içindeki hücre ölümü için normalleştirilmiş bir değer elde etmek için apoptoz pozitif hücrelerin sayısını bölgeye bölün. Hedef hücre ölümüne neden olan deoksiSA konsantrasyonunu belirledikten sonra, grup başına en az beş organoid ile yaklaşık olarak aynı boyut ve şekildeki üç organoid grubunu seçmek için steril bir prob kullanın. Ve grupları ultra düşük bir ataşman 6 delikli plakanın bireysel kuyucuklarına ekleyin.
DeoksiSA'nın hedef hücre ölüm konsantrasyonunu, ilgilenilen ilaç veya kontrol ortamı ile desteklenmiş deoksiSA'nın hedef hücre ölüm konsantrasyonunu uygun kuyucuğa veya organoidlere ekleyin. İki gün sonra, her bir kuyucuktaki süpernatantı uygun konsantrasyonda taze tedavi veya kontrol ortamı ile değiştirin. Dört günlük kültürden sonra, kültürleri gösterildiği gibi hücre ölümü için değerlendirin.
Bu temsili analizde, maküler olmayan telanjiektazi tip 2 kontrolüne bağlı pluripotent kök hücre hattından üretilen retinal organoidler dört konsantrasyonda deoksiSA ile tedavi edildi. DeoksiSA'ya yanıt olarak hücre ölümü konsantrasyona bağımlıydı ve 50 nanomolar deoksiSA kadar az bir sürede tespit edilebilirdi. Test edilen en yüksek konsantrasyon, retinal organoidin bütünlüğünü korurken sağlam bir hücre ölümüne neden oldu.
20 mikromolar fenofibrat ile tedavi, retinal organoidlerin foto reseptörlerinde deoksiSA kaynaklı toksisiteyi önledi ve dört günlük tedaviden sonra hücre ölümünü yaklaşık% 80 oranında önemli ölçüde azalttı. Tahlilin retina hücrelerinde yapıldığından emin olmak için iyi biçimlendirilmiş ve sağlıklı organoidleri seçmeyi unutmayın. Organoidler, gen ekspresyonunu ölçmek için RNA toplanması için işlenebilir, bu da stres sinyallerinin değerlendirilmesine ve toksik etkilerin ve kurtarmaların doğrulanmasına izin verir.
Bu tekniği kullanarak, organoidlerdeki birçok farklı lipitin aşağı akış metabolizmasını test edebildik ve insan retinalarında lipit metabolizması çalışmasını açtık.
