תיוג תא יחיד והדמיה של arbors דנדריטי או אקסוני נדרש לחקור מורפוגנזה עצבית. על ידי תיוג פיתוח arbors באופן זעיר פולשני, רקמת הרשתית נשארת בריאה ומתאימה להדמיה חיה קונפוקלית ממושכת. היתרון העיקרי של שיטה זו הוא היכולת לדמיין arbors בודדים עם חלבונים פלואורסצנטיים צבעוניים מרובי צבעים בתוך ארבעה ימים לאחר ההזרקה.
זה הופך את לימוד מורפולוגיות ארבור יילודים לאפשריות. פרוטוקול הדמיה וניתוח הזרקה זה יכול לשמש כדי ללמוד מורפולוגיות עצביות ברחבי מערכת העצבים המרכזית. בחירת Cre מתאימה ומיקום הזרקה חייבים להיות נחושים כדי למקד את אוכלוסיית התאים של עניין.
התחל על ידי בחירת קו עכבר Cre כדי לתייג את אוכלוסיות תאי הרשתית של עניין. להשיג רקומבינאז תלוי AAV וירוס קידוד חלבונים פלואורסצנטיים. לקבלת תיוג אופטימלי של תהליכים עדינים, בחר וקטורים המבטאים חלבונים פלואורסצנטיים מותאמים המתמקדים בקרום הפלזמה.
עבור aliquot AAV על קרח, ולהכין דילול AAV אחד עד ארבעה באמצעות תמיסת מלח סטרילית או PBS. כדי לדמיין את הזריקות, צבע את הפתרון בכחול על-ידי הוספת מיקרוליטר אחד של 0.02% פתרון צבע FCF מהיר ירוק עבור כל 15 מיקרוליטרים של דילול AAV. לחטא את אזור ההזרקה עם 70% אתנול.
מלאו את המיקרופיפט בדילול AAV באמצעות מיקרו-מזרק. תחת מיקרוסקופ סטריאו, לשבור את קצה micropipette עם מחט 30-מד כדי לפתוח את הקצה. לאחר המרדים את העכברים היילודים, לקעקע את רפידות כף רגליהם עם דיו קעקוע באמצעות מחט 30-מד כדי לזהות את החיות.
לאסוף גזירי זנב לבידוד DNA ו genotyping. ספוגית העור מעל העיניים עם 70% אתנול. השתמש במחט 30 מד כדי לפתוח את העפעף המותך תוך הפעלת לחץ אור עם האצבעות כדי לפתוח את העין.
לתקוע חור קטן דרך הקרנית בצומת sclera הקרנית. הכנס את micropipette הזכוכית לתוך החור ולחץ על דוושת רגל מזרק מיקרו פעמיים עד ארבע פעמים כדי להזריק את AAV לתוך החלל התוך-צדדי. הסר באיטיות את המיקרופיפט ואשר הזרקת AAV על ידי הדמיית הצבע הכחול באישון.
לאחר הכנת רשתית aCSF כמתואר בכתב היד טקסט, לחמצן את רשתית aCSF על ידי מבעבע עם קרבוגן לפחות 15 דקות, ולאחר מכן להתאים את ה- pH ל 7.4. הטמע צלחת פטרי בקוטר 60 מילימטר לתוך מגש קרח ומלא אותו עם aCSF רשתית מחומצנת. מניחים את צלחת הפטרי הממולאת מתחת למיקרוסקופ סטריאו.
לאחר מכן, לחתוך את דש העפעף של העכבר המתת חסד כדי לחשוף את העין. השתמש מלקחיים קהים כדי enucleate העיניים ולהעביר אותם לתוך רשתית קרה aCSF להציב מתחת למיקרוסקופ סטריאו. תחת מיקרוסקופ הסטריאו, לייצב את העין על ידי הידוק עצב הראייה באמצעות Dumont מספר חמש מלקחיים ולדקור חור במרכז הקרנית עם מחט 30 מד, ולאחר מכן להכניס קצה אחד של מספריים מיקרו לתוך החור כדי לבצע חתך מהחור עד סוף הקרנית.
חוזרים על הפעולה כדי ליצור ארבע פרוסות בכיוונים הקרדינליים, ויוצרים ארבעה מדפים. אוחזים ומפרקים את שני המדפים הסמוכים, מקלפים בעדינות את הסקלרה מהרשתית עבור כל מדפים הקרנית. לאחר מכן להסיר את העדשה מכוס הרשתית באמצעות מלקחיים.
לבסוף, השתמש במספריים מיקרו כדי לבצע ארבעה חתכים רדיאליים מקצה הרשתית לכיוון עצב הראייה, יצירת ארבעה עלי כותרת שווים. אם אתם משתמשים במסנני קרום MCE אפורים בקוטר גדול להרכבה, חתכו את הדיסק לרביעים שרוחבם בערך סנטימטר אחד, ולאחר מכן הניחו את דיסק ה-MCE על מרכז נייר סינון לבן גדול יותר. בעזרת שתי מברשות צבע בגודל שלוש על אפס, הפוך רשתית אחת על מברשת צבע עם צד תא גנגליון הרשתית כלפי מטה.
הרם בעדינות את הרשתית מתוך ה- ACSF, וודא שמתח המים אינו קורע את הרשתית. בעודם מחזיקים את מברשת הצבע עם הרשתית, הזיזו את צלחת הפטרי המכילה ACSF מהדרך והניחו את נייר הסינון הלבן עם קרום ה- MCE מתחת לסטריאוסקופ. באמצעות פיפטת העברה, מקם טיפה של aCSF במרכז נייר הסינון של MCE.
צף את הרשתית לתוך טיפת aCSF שנוצרה על ידי מתח פני השטח וטעון MCE קרום. השתמש מברשות צבע כדי למקם את הרשתית בתוך טיפה עם צד תא גנגליון רשתית למעלה, ולאחר מכן לפתוח את ארבעת עלי הכותרת. לאחר מיקום, ליצור גשר מים בין מברשת צבע ונייר סינון לבן כדי לשבור את מתח פני השטח של טיפה.
להרכיב את תא הדגירה הדמיה חיה ולמלא אותו עם ACSF מחומצן. הפעל את משאבת בקר הטמפרטורה, לוודא כי הטמפרטורה אינה עולה מעל 34 מעלות צלזיוס. זה יכול לקחת עד שעה לטמפרטורת התא להתייצב.
מומלץ להקים את תא הדגירה לפני תחילת ניתוח הרשתית. טמפרטורת תא יציבה מסייעת להפחית את הסחף לדוגמה. כדי להעביר את התל השטוח ברשתית לתא הזלוף, לעצור את המשאבה ולהסיר את aCSF כי הוא בתא.
לאחר מכן הנח את דיסק MCE עם הרכבה שטוחה ברשתית לתוך תא הדגירה. הרטיבו מראש משקל מדגם כדי לשבור את מתח פני השטח, ולאחר מכן הניחו אותו על ההרכבה השטוחה כדי להבטיח שמשקל הדגימה יונח על נייר ה- MCE כדי להפחית את הסחף לדוגמה. מלאו מחדש את התא ב-ACSF המחומם והפיצו את ה-ACSF במהירות של כמיליליטר לדקה.
מקם את האף עם המטרה 25 פעמים טבילת מים לתוך חדר ההדמיה. מסך עבור תאים מסומנים בעלי תווית של עניין באמצעות אור epifluorescent, ולהתאים את עוצמת ההדמיה כדי ללכוד תכונות דנדריטיות של עניין. באמצעות טבלת בדיקת מידע המזהה הן פיקסלים רוויים יתר על המידה והן פיקסלים לא רוויים, התאם את עוצמת הלייזר כך שלא יהיו פיקסלים רוויים יתר על המידה.
רכשו את נפח ההדמיה התלת-ממדית וחזרו על הרכישה בקצב הפריימים הרצוי. ניתן לכוונן את נפח ההדמיה בין כל נקודת זמן כדי לפצות על סחף לדוגמה. יבא את סדרת התמונות, תוך פיצול התמונות לפי זמן.
שמור את כל נקודות הזמן באופן ידני או על-ידי הפעלת תוסף מאקרו. צור פונקציית התפשטות נקודה תיאורטית באמצעות תוסף ImageJ על-ידי לחיצה על Defraction PSF 3D, צמצם מספרי של עדשה, אורך גל של פליטת פלואורופור, גודל פיקסלים ומרווח Z נדרשים כדי ליצור PSF מדויק. בחר תוספים, פקודות מאקרו ופעל כדי לבצע פירוק איטרטיבי מקביל של אצווה עבור כל נקודות הזמן באמצעות המאקרו שסופק.
יבא את כל נקודות הזמן המנותקות כערימה על-ידי לחיצה על קובץ, ייבוא ולאחר מכן רצף תמונות. המר את הערימה לערימת יתר על-ידי לחיצה על תמונה, ערימות יתר ולאחר מכן ערימות לערימת יתר. הוסיפו את מספר פרוסות Z ומסגרות הזמן, ולאחר מכן תקןו את הסחף התלת-ממדי באמצעות תוסף הסחף התלת-ממדי הנכון.
שמור את ערימת העל המתוקנת של הסחף התלת-ממדי והמרה את התמונה בחזרה לערימה רגילה על-ידי לחיצה על תמונה, ערימות-על, ערימות יתר, ערימות, ערימות, ערימות וערימות מפצל. כדי שמספר ערמות המשנה שיש לפצל, הזן את מספר נקודות הזמן. השתמש בעיבוד אצווה כדי ליצור הקרנה מרבית עבור כל נקודות הזמן.
יבא את רצף התמונה לשגות זמן על-ידי לחיצה על קובץ, ייבוא ולאחר מכן רצף תמונות. ולהשתמש בכלי ImageJ קונבנציונליים לניתוח הרצוי של וידאו דו מימדי מפורק ופוסט מעובד, וידאו 3D ברזולוציה גבוהה של דנדריטים תא starburst פיתוח נרכש, טוהר, ותוקן עבור סחיפה 3D. תחזיות מקסימליות של מטוס Z הופקו כדי ליצור קטעי וידאו דו-ממדיים לניתוח, המציגים אזור של עידון דנדריטי ואזור של צמיחה דנדריטית.
3D deconvolution של כל נקודת זמן הגדיל את הרזולוציה של תחזיות פילופודיה בסדר של תא amacrine כוכב P6 יחיד לפני ואחרי deconvolution עם ImageJ. תקופות זיהום AAV ממושכות לא בהכרח להוביל אות פלואורסצנטי מוגבר כפי שמוצג על ידי רמות דומות של ביטוי חלבון בחמישה ו 11 ימים לאחר ההזרקה. הפחתת הסחף מדגם במהלך הדמיה חשובה.
סחיפה ממוזערת על ידי שמירה על טמפרטורת הדמיה עקבית ועל ידי מיקום הולם של המשקל על המדגם. אם מתרחשת דריפט, רכישה ידנית של סדרת הזמן מאפשרת התאמה של אמצעי האחסון להדמיה בין מסגרות. פעולה זו מבטיחה את התכונות של עניין להישאר במסגרת.
פרוטוקול זה מייצר קטעי וידאו תלת-ממדיים ברזולוציה גבוהה, פירוק ותיקון נסחף של נוריטים מתפתחים. קטעי וידאו כאלה מובילים להבנה טובה יותר של חיווט נוירונים ונדרשים לקדם שיטות ניתוח חישוביות של מורפוגנזה 3D. תוכנות מעקב ומעקב אוטומטיות טובות יותר נדרשות כדי להשיג ניתוח תפוקה גבוהה של פיתוח neurite.
