A rotulagem e visualização de células únicas de árvores dendríticas ou axonais é necessária para estudar morfogênese neuronal. Ao rotular as arbors em desenvolvimento de forma minimamente invasiva, o tecido retiniano permanece saudável e adequado para imagens vivas confocal prolongadas. A principal vantagem deste método é a capacidade de visualizar arboris individuais com proteínas fluorescentes multicoloras dentro de quatro dias após a injeção.
Isso torna possível estudar morfologias de arbor neonatal. Este protocolo de imagem e análise de injeção pode ser usado para estudar morfologias neuronais em todo o sistema nervoso central. O local apropriado de seleção e injeção de Cre deve ser determinado para atingir a população celular de interesse.
Comece selecionando uma linha de mouse Cre para rotular as populações de células retinárias de interesse. Obtenha vírus AAV dependente de recombinase codificando proteínas fluorescentes. Para uma rotulagem ideal de processos finos, selecione vetores que expressem proteínas fluorescentes modificadas visando a membrana plasmática.
Para a alíquota AAV no gelo, e prepare uma diluição de um a quatro AAV usando soro fisiológico estéril ou PBS. Para visualizar as injeções, colora a solução azul adicionando aproximadamente um microliter de 0,02% solução de corante FAST Green FCF para cada 15 microlitros de diluição AAV. Esterilize a área de injeção com 70% de etanol.
Enchimento de micropipette com a diluição AAV usando uma microsinga. Sob um microscópio estereo, quebre a ponta da micropipette com uma agulha de calibre 30 para deslatar a ponta. Depois de anestesiar os camundongos neonatais, tatue suas patas com tinta de tatuagem usando uma agulha de calibre 30 para identificar os animais.
Colete recortes de cauda para isolamento de DNA e genotipagem. Limpe a pele sobrepondo os olhos com 70% de etanol. Use uma agulha de calibre 30 para abrir a pálpebra fundida enquanto aplica pressão leve com os dedos para abrir o olho.
Faça um pequeno buraco na córnea na junção da córnea esclera. Insira o micropipette de vidro no orifício e pressione o micro pedal do pé injetor duas a quatro vezes para injetar o AAV no espaço intravitreal. Remova lentamente a micropipette e confirme a injeção de AAV visualizando o corante azul na pupila.
Depois de preparar a aCSF da retina como descrito no manuscrito do texto, oxigene o aCSF da retina borbulhando com carbogen por um mínimo de 15 minutos, em seguida, ajuste o pH para 7,4. Incorpore uma placa de Petri de 60 milímetros de diâmetro em uma bandeja de gelo e encha-a com aCSF de retina oxigenada. Coloque a placa de Petri cheia sob um microscópio estéreo.
Em seguida, corte a aba das pálpebras do rato eutanizado para expor o olho. Use fórceps contundentes para enuclear os olhos e transferi-los para a aCSF de retina fria colocada sob o microscópio estéreo. Sob o microscópio estéreo, estabilize o olho apertando o nervo óptico usando o pedórbico dumont número cinco e faça um buraco no centro da córnea com uma agulha de calibre 30, em seguida, insira uma ponta da micro tesoura no orifício para fazer uma incisão do orifício até o fim da córnea.
Repita fazer quatro fatias nas direções cardeais, criando quatro retalhos. Segure e puxe os dois retalhos adjacentes, descascando suavemente a esclera da retina para todos os retalhos de córnea. Em seguida, remova a lente do copo de retina usando os fórceps.
Por fim, use micro tesouras para fazer quatro incisões radiais da borda da retina em direção ao nervo óptico, criando quatro pétalas iguais. Se usar filtros de membrana MCE cinza de grande diâmetro para montagem, corte o disco em quadrantes com aproximadamente um centímetro de diâmetro e coloque o disco MCE no centro de um papel filtro branco maior. Usando dois pincéis de tinta tamanho três por zero, vire um copo de retina em um pincel com o lado da célula gânglio da retina para baixo.
Retire suavemente a retina do aCSF, certificando-se de que a tensão da água não rasgue a retina. Enquanto ainda segura a escova de tinta com a retina, mova a placa de Petri contendo aCSF para fora do caminho e coloque o papel filtro branco com a membrana MCE sob o estereoscópio. Usando uma pipeta de transferência, coloque uma gota de aCSF no centro do papel filtro MCE.
Flutue a retina para a gotícula aCSF criada pela tensão superficial e membrana MCE carregada. Use pincéis de tinta para posicionar a retina dentro da gota com o lado da célula gânglio da retina para cima, em seguida, desdobre as quatro pétalas. Uma vez posicionado, crie uma ponte de água entre o pincel e o papel filtro branco para quebrar a tensão superficial da gotícula.
Monte a câmara de incubação de imagens ao vivo e preencha-a com aCSF oxigenada. Ligue a bomba e o controlador de temperatura, certificando-se de que a temperatura não suba acima de 34 graus Celsius. Pode levar até uma hora para a temperatura da câmara estabilizar.
Recomenda-se configurar a câmara de incubação antes de iniciar a dissecção da retina. A temperatura estável da câmara ajuda a reduzir a deriva da amostra. Para transferir o monte plano de retina para a câmara de perfusão, pare a bomba e remova o aCSF que está na câmara.
Em seguida, coloque o disco MCE com o suporte plano de retina na câmara de incubação. Pré-molhar um peso amostral para quebrar a tensão da superfície e, em seguida, colocá-lo sobre o suporte plano garantindo que o peso da amostra seja colocado no papel MCE para reduzir a deriva amostral. Reabastecer a câmara com o aCSF aquecido e circular aCSF a aproximadamente um mililitro por minuto.
Posicione a peça do nariz com o objetivo de mergulhar 25 vezes na câmara de imagem. Tela para células rotuladas de interesse usando luz epifluorescente, e ajustar o volume de imagem para capturar características dendríticas de interesse. Usando uma tabela de procuração que identifica pixels supersaturados e subsaturados, ajuste a potência do laser de modo que nenhum pixel esteja supersaturado.
Adquira o volume de imagem 3D e repita a aquisição na taxa de quadros desejada. O volume de imagem pode ser ajustado entre cada ponto de tempo para compensar a deriva da amostra. Importe a série de imagens, dividindo as imagens pelo tempo.
Economize todos os pontos de tempo manualmente ou executando um plugin macro. Crie uma função de spread de ponto teórico usando o plugin ImageJ clicando em Defraction PSF 3D, abertura numérica da lente, comprimento de onda de emissão de fluoroforeiro, tamanho do pixel e espaçamento Z são necessários para criar um PSF preciso.
Importe todos os pontos de tempo desconvolvados como uma pilha clicando em arquivo, importação e sequência de imagem. Converta a pilha em um hipersepilante clicando em imagem, hipersilha e, em seguida, empilha para hiperstack. Adicione o número de fatias Z e prazos, em seguida, corrija a deriva 3D usando o plugin de deriva 3D correto.
Salve o hipersedor corrigido em deriva 3D e converta a imagem de volta em uma pilha regular clicando em imagem, hipersilhadas, hipersemonia para empilhar e, em seguida, divida os pontos de tempo clicando em imagem, pilhas, ferramentas e divisor de pilhas. Para que o número de subssares seja dividido, digite o número de pontos de tempo. Use o processamento em lote para criar uma projeção máxima para todos os pontos de tempo.
Importe a sequência de imagem de lapso de tempo clicando no arquivo, importe e, em seguida, sequência de imagem. E use ferramentas convencionais imageJ para a análise desejada de vídeo bidimensional desconvolved e pós-processado, um vídeo 3D de alta resolução de dendritos de células de explosão estelar foi adquirido, desconvolved e corrigido para deriva 3D. Foram produzidas projeções máximas de plano Z para fazer vídeos 2D para análise, mostrando uma área de refinamento dendrático e uma área de crescimento dendrático.
A desconvolução 3D de cada ponto de tempo aumentou a resolução de projeções finas de filopodia fina de célula amacrina p6 única antes e depois da desconvolução com ImageJ. Períodos prolongados de infecção por AAV não levam necessariamente ao aumento do sinal fluorescente, como mostrado por níveis semelhantes de expressão proteica em cinco e 11 dias após a injeção. Reduzir a deriva da amostra durante a imagem é importante.
A deriva é minimizada pela manutenção de uma temperatura de imagem consistente e pelo posicionamento adequado do peso na amostra. Se ocorrer deriva, a aquisição manual da série temporal permite o ajuste do volume de imagem entre os quadros. Isso garante que as características de interesse permaneçam no quadro.
Este protocolo produz vídeos 3D de alta resolução, desconvolved e corrige à deriva de neurites em desenvolvimento. Tais vídeos levam a uma melhor compreensão da fiação dos neurônios e são necessários para avançar os métodos de análise computacional da morfogênese 3D. Melhores softwares de rastreamento e rastreamento automáticos são necessários para obter uma análise de alto rendimento do desenvolvimento de neurite.
