Die Einzelzellmarkierung und Visualisierung von dendritischen oder axonalen Lauben ist erforderlich, um die neuronale Morphogenese zu untersuchen. Durch die minimal-invasive Kennzeichnung von sich entwickelnden Lauben bleibt das Netzhautgewebe gesund und für eine längere konfokale Live-Bildgebung geeignet. Der Hauptvorteil dieser Methode ist die Möglichkeit, einzelne Lauben mit mehrfarbigen fluoreszierenden Proteinen innerhalb von vier Tagen nach der Injektion sichtbar zu machen.
Dies ermöglicht die Untersuchung neonataler Laubenmorphologien. Dieses Injektionsbildgebungs- und Analyseprotokoll kann verwendet werden, um neuronale Morphologien im gesamten Zentralnervensystem zu untersuchen. Die geeignete Cre-Selektion und der Injektionsort müssen so bestimmt werden, dass sie auf die interessierende Zellpopulation abzielen.
Beginnen Sie mit der Auswahl einer Cre-Mauslinie, um die interessierenden Netzhautzellpopulationen zu kennzeichnen. Erhalten Sie ein rekombinaseabhängiges AAV-Virus, das für fluoreszierende Proteine kodiert. Für eine optimale Markierung von Feinprozessen wählen Sie Vektoren, die modifizierte fluoreszierende Proteine exprimieren, die auf die Plasmamembran abzielen.
Für das AAV-Aliquot auf Eis und bereiten Sie eine ein- bis vierfache AAV-Verdünnung mit steriler Kochsalzlösung oder PBS vor. Um die Injektionen zu visualisieren, färben Sie die Lösung blau, indem Sie etwa einen Mikroliter 0,02% Fast Green FCF-Farbstofflösung pro 15 Mikroliter AAV-Verdünnung hinzufügen. Sterilisieren Sie den Injektionsbereich mit 70% Ethanol.
Füllen Sie die Mikropipette mit einer Mikrospritze mit der AAV-Verdünnung ab. Brechen Sie unter einem Stereomikroskop die Mikropipettenspitze mit einer 30-Gauge-Nadel, um die Spitze abzudichten. Nachdem Sie die neonatalen Mäuse betäubt haben, tätowieren Sie ihre Pfotenpolster mit Tätowierfarbe mit einer 30-Gauge-Nadel, um die Tiere zu identifizieren.
Sammeln Sie Schwanzausschnitte für die DNA-Isolierung und Genotypisierung. Tupfen Sie die Haut über den Augen mit 70% Ethanol ab. Verwenden Sie eine 30-Gauge-Nadel, um das verschmolzene Augenlid zu öffnen, während Sie leichten Druck mit den Fingern ausüben, um das Auge zu öffnen.
Stecken Sie ein kleines Loch durch die Hornhaut an der Hornhaut-Sklera-Kreuzung. Setzen Sie die Glasmikropipette in das Loch ein und drücken Sie das Mikroinjektor-Fußpedal zwei- bis viermal, um das AAV in den intravitrealen Raum zu injizieren. Entfernen Sie langsam die Mikropipette und bestätigen Sie die AAV-Injektion, indem Sie den blauen Farbstoff in der Pupille sichtbar machen.
Nachdem Sie das retinale aCSF wie im Textmanuskript beschrieben hergestellt haben, sauerstoffreichen Sie das retinale aCSF, indem Sie mindestens 15 Minuten lang mit Carbogen sprudeln, und stellen Sie dann den pH-Wert auf 7,4 ein. Betten Sie eine Petrischale mit einem Durchmesser von 60 Millimetern in eine Eisschale ein und füllen Sie sie mit sauerstoffreichem retinalem aCSF. Legen Sie die gefüllte Petrischale unter ein Stereomikroskop.
Als nächstes schneiden Sie den Augenlidlappen der eingeschläferten Maus ab, um das Auge freizulegen. Verwenden Sie stumpfe Pinzetten, um die Augen zu enukleieren und sie in das kalte retinale aCSF unter dem Stereomikroskop zu übertragen. Stabilisieren Sie unter dem Stereomikroskop das Auge, indem Sie den Sehnerv mit der Dumont-Pinzette Nummer fünf umklammern und mit einer 30-Gauge-Nadel ein Loch in die Mitte der Hornhaut stechen, dann eine Spitze der Mikroschere in das Loch einführen, um einen Schnitt vom Loch bis zum Ende der Hornhaut zu machen.
Wiederholen Sie den Vorgang, um vier Scheiben in die Himmelsrichtungen zu machen und vier Klappen zu erzeugen. Greifen und ziehen Sie die beiden benachbarten Klappen auseinander und schälen Sie die Sklera vorsichtig von der Netzhaut für alle Hornhautklappen. Entfernen Sie dann die Linse mit der Pinzette aus der Netzhauttasse.
Verwenden Sie schließlich eine Mikroschere, um vier radiale Schnitte vom Rand der Netzhaut in Richtung Sehnerv zu machen, wodurch vier gleiche Blütenblätter entstehen. Wenn Sie graue MCE-Membranfilter mit großem Durchmesser für die Montage verwenden, schneiden Sie die Scheibe in Quadranten mit einem Durchmesser von etwa einem Zentimeter und legen Sie die MCE-Scheibe dann auf die Mitte eines größeren weißen Filterpapiers. Drehen Sie mit zwei Pinseln der Größe drei mal Null einen Netzhautbecher auf einen Pinsel, wobei die retinale Ganglienzelle mit der Seite nach unten zeigt.
Heben Sie die Netzhaut vorsichtig aus dem aCSF heraus und stellen Sie sicher, dass die Wasserspannung die Netzhaut nicht reißt. Während Sie den Pinsel noch mit der Netzhaut halten, bewegen Sie die Petrischale mit aCSF aus dem Weg und legen Sie das weiße Filterpapier mit der MCE-Membran unter das Stereoskop. Legen Sie mit einer Transferpipette einen Tropfen aCSF in die Mitte des MCE-Filterpapiers.
Schweben Sie die Netzhaut in das aCSF-Tröpfchen, das durch die Oberflächenspannung und die geladene MCE-Membran erzeugt wird. Verwenden Sie Pinsel, um die Netzhaut innerhalb des Tröpfchens mit der Rückseite der retinalen Ganglienzelle nach oben zu positionieren, und entfalten Sie dann die vier Blütenblätter. Sobald Sie positioniert sind, erstellen Sie eine Wasserbrücke zwischen dem Pinsel und dem weißen Filterpapier, um die Oberflächenspannung des Tröpfchens zu brechen.
Montieren Sie die Live-Imaging-Inkubationskammer und füllen Sie sie mit sauerstoffhaltigem aCSF. Schalten Sie die Pumpe und den Temperaturregler ein und achten Sie darauf, dass die Temperatur nicht über 34 Grad Celsius steigt. Es kann bis zu einer Stunde dauern, bis sich die Kammertemperatur stabilisiert hat.
Es wird empfohlen, die Inkubationskammer vor Beginn der Netzhautdissektion einzurichten. Stabile Kammertemperatur hilft, die Probendrift zu reduzieren. Um den retinalen flachen Hügel in die Perfusionskammer zu übertragen, stoppen Sie die Pumpe und entfernen Sie den aCSF, der sich in der Kammer befindet.
Legen Sie dann die MCE-Disc mit der retinalen flachen Halterung in die Inkubationskammer. Benetzen Sie ein Probengewicht vor, um die Oberflächenspannung zu brechen, und legen Sie es dann auf die flache Halterung, um sicherzustellen, dass das Probengewicht auf das MCE-Papier gelegt wird, um die Probendrift zu reduzieren. Füllen Sie die Kammer mit dem erwärmten aCSF auf und zirkulieren Sie aCSF mit etwa einem Milliliter pro Minute.
Positionieren Sie den Nasenhalter mit dem 25-fachen Wassertauchobjektiv in der Bildgebungskammer. Suchen Sie mit epifluoreszierendem Licht nach markierten Zellen von Interesse und passen Sie das Bildgebungsvolumen an, um dendritische Merkmale von Interesse zu erfassen. Passen Sie die Laserleistung mithilfe einer Nachschlagetabelle an, die sowohl übersättigte als auch untersättigte Pixel identifiziert, sodass keine Pixel übersättigt sind.
Erfassen Sie das 3D-Bildvolumen und wiederholen Sie die Aufnahme mit der gewünschten Bildrate. Das Bildvolumen kann zwischen den einzelnen Zeitpunkten eingestellt werden, um die Probendrift zu kompensieren. Importieren Sie die Bildserie und teilen Sie die Bilder nach Zeit auf.
Speichern Sie alle Zeitpunkte manuell oder durch Ausführen eines Makro-Plugins. Erstellen Sie eine theoretische Punktspreizfunktion mit dem ImageJ-Plugin, indem Sie auf Defraction PSF 3D klicken, die numerische Blende des Objektivs, die Fluorophor-Emissionswellenlänge, die Pixelgröße und der Z-Abstand sind erforderlich, um eine genaue PSF zu erstellen. Wählen Sie Plug-ins und Makros aus, und führen Sie sie aus, um eine parallele iterative Dekonvolution für alle Zeitpunkte mithilfe des bereitgestellten Makros durchzuführen.
Importieren Sie alle verdrehten Zeitpunkte als Stapel, indem Sie auf Datei, Import und dann auf Bildsequenz klicken. Konvertieren Sie den Stack in einen Hyperstack, indem Sie auf image, hyperstacks und dann auf stacks in hyperstacks klicken. Fügen Sie die Anzahl der Z-Slices und Zeitrahmen hinzu und korrigieren Sie dann die 3D-Drift mit dem richtigen 3D-Drift-Plugin.
Speichern Sie den 3D-Drift-korrigierten Hyperstack und konvertieren Sie das Bild zurück in einen normalen Stack, indem Sie auf Image, Hyperstacks, Hyperstack to Stack klicken und dann die Zeitpunkte teilen, indem Sie auf Image, Stacks, Tools und Stacks Splitter klicken. Geben Sie für die Anzahl der aufzuteilenden Teilstapel die Anzahl der Zeitpunkte ein. Verwenden Sie die Stapelverarbeitung, um eine maximale Projektion für alle Zeitpunkte zu erstellen.
Importieren Sie die Zeitraffer-Bildsequenz, indem Sie auf Datei, Import und dann auf Bildsequenz klicken. Und verwenden Sie herkömmliche ImageJ-Tools für die gewünschte Analyse von dekonvolvierten und nachbearbeiteten zweidimensionalen Videos, Ein hochauflösendes 3D-Video der Entwicklung von Starburst-Zelldendriten wurde aufgenommen, dekonvolviert und für 3D-Drift korrigiert. Maximale Projektionen der Z-Ebene wurden erstellt, um 2D-Videos für die Analyse zu erstellen, die einen Bereich der dendritischen Verfeinerung und einen Bereich des dendritischen Auswuchses zeigen.
Die 3D-Dekonvolution jedes Zeitpunkts erhöhte die Auflösung von feinen Filopodienprojektionen einzelner P6-Starburst-Amakrinzellen vor und nach der Dekonvolution mit ImageJ. Längere AAV-Infektionsperioden führen nicht unbedingt zu einem erhöhten Fluoreszenzsignal, wie ähnliche Proteinexpression fünf und 11 Tage nach der Injektion zeigen. Es ist wichtig, die Probendrift während der Bildgebung zu reduzieren.
Die Drift wird minimiert, indem eine konstante Abbildungstemperatur aufrechterhalten und das Gewicht auf der Probe entsprechend positioniert wird. Wenn eine Drift auftritt, ermöglicht die manuelle Erfassung der Zeitreihe die Anpassung des Bildvolumens zwischen den Frames. Dadurch wird sichergestellt, dass die interessierenden Merkmale im Rahmen bleiben.
Dieses Protokoll erzeugt hochauflösende, dekonvolvierte und driftkorrigierte 3D-Videos von sich entwickelnden Neuriten. Solche Videos führen zu einem besseren Verständnis der Neuronenverdrahtung und sind erforderlich, um computergestützte Analysemethoden der 3D-Morphogenese voranzutreiben. Bessere automatische Tracing- und Tracking-Software ist erforderlich, um eine Hochdurchsatzanalyse der Neuritenentwicklung zu erreichen.
