樹状樹木または軸索樹木の単一細胞標識および可視化は、ニューロン形態形成を研究するために必要である。低侵襲の方法で発達中の樹木を標識することにより、網膜組織は健康を維持し、長期の共焦点ライブイメージングに適しています。この方法の主な利点は、注射後4日以内に多色蛍光タンパク質で個々の樹木を視覚化できることです。
これにより、新生児の樹木の形態を研究することが可能になります。この注射イメージングおよび解析プロトコルは、中枢神経系全体のニューロン形態を研究するために使用することができる。適切なCre選択および注入場所は、目的の細胞集団を標的とするために決定されなければならない。
まず、Creマウスラインを選択して、目的の網膜細胞集団を標識します。蛍光タンパク質をコードするリコンビナーゼ依存性AAVウイルスを取得する。微細プロセスの最適な標識のために、原形質膜を標的とする修飾蛍光タンパク質を発現するベクターを選択する。
氷上のAAVアリコートについて、滅菌生理食塩水またはPBSを用いて1〜4個のAAV希釈液を調製した。注射を視覚化するには、15マイクロリットルのAAV希釈ごとに約1マイクロリットルの0.02%Fast Green FCF染料溶液を加えて、溶液を青色に着色します。注射領域を70%エタノールで滅菌する。
マイクロシリンジを用いてAAV希釈液でマイクロピペットをバックフィルする。実体顕微鏡下で、マイクロピペットチップを30ゲージの針で破り、先端のシールを解除します。新生児マウスを麻酔した後、30ゲージの針を使用して足パッドにタトゥーインクを入れ墨し、動物を識別します。
DNA単離とジェノタイピングのために尾の切り抜きを収集します。目の上にある皮膚を70%エタノールで拭きます。30ゲージの針を使用して融合したまぶたを開き、指で軽い圧力をかけて目を開きます。
角膜強膜接合部の角膜に小さな穴をあけます。ガラス製マイクロピペットを穴に挿入し、マイクロインジェクターフットペダルを2~4回押して、AAVを硝子体内空間に注入します。マイクロピペットをゆっくりと取り出し、瞳孔内の青色色素を可視化してAAV注入を確認します。
本文原稿に記載されているように網膜aCSFを調製した後、カルボーゲンで最低15分間バブリングすることによって網膜aCSFを酸素化し、次いでpHを7.4に調整する。直径60ミリメートルのペトリ皿をアイストレイに埋め込み、酸素化網膜aCSFで満たします。充填したシャーレを実体顕微鏡下に置く。
次に、安楽死させたマウスのまぶたのフラップを切って目を露出させます。鈍い鉗子を使用して目を除核させ、実体顕微鏡下に置かれた冷たい網膜aCSFに移します。実体顕微鏡下で、デュモン数5鉗子で視神経を挟み、角膜中央に30ゲージの針で穴をあけて目を安定させ、マイクロハサミの先端を穴に差し込み、穴から角膜の端まで切開します。
この手順を繰り返して、基本方向に 4 つのスライスを作成し、フラップを 4 つ作成します。隣接する2つのフラップをつかんで引き離し、すべての角膜フラップのために網膜から強膜を静かに剥離します。その後、鉗子を使用して網膜カップからレンズを取り外します。
最後に、マイクロハサミを使用して網膜の端から視神経に向かって4つの橈骨切開を行い、4つの等しい花弁を作成します。取り付けに大口径グレーのMCEメンブレンフィルターを使用する場合は、ディスクを直径約1センチの象限に切断し、MCEディスクを大きな白いろ紙の中央に置きます。2つのサイズ3×ゼロのペイントブラシを使用して、網膜神経節細胞を裏にしたペイントブラシに1つの網膜カップを反転させます。
網膜をaCSFから静かに持ち上げ、水張力が網膜を引き裂かないようにします。網膜でペイントブラシを握ったまま、aCSFを含むペトリ皿を邪魔にならないように動かし、MCE膜の付いた白いろ紙をステレオスコープの下に置きます。トランスファーピペットを用いて、MCEろ紙の中央にaCSFの液滴を置く。
表面張力によって作成されたaCSF液滴に網膜を浮遊させ、MCE膜を荷電させた。ペイントブラシを使用して、網膜神経節細胞側を上にして液滴内の網膜を配置し、4つの花びらを広げます。配置したら、ペイントブラシと白いろ紙の間に水橋を作り、液滴の表面張力を壊します。
ライブイメージングインキュベーションチャンバーを組み立て、酸素化aCSFで満たします。ポンプと温度コントローラの電源を入れ、温度が摂氏34度を超えないようにします。チャンバーの温度が安定するまでに最大1時間かかることがあります。
網膜解剖を開始する前にインキュベーションチャンバーを設置することをお勧めします。安定したチャンバ温度は、サンプルドリフトの低減に役立ちます。網膜平らなマウンドを灌流チャンバーに移すには、ポンプを停止し、チャンバー内にあるaCSFを除去する。
次に、網膜フラットマウントを備えたMCEディスクをインキュベーションチャンバに入れます。サンプル重量をプリウェットして表面張力を損ない、それをフラットマウントの上に置き、サンプル重量がMCE紙上に置かれるようにしてサンプルドリフトを低減します。チャンバーに加温したaCSFを補充し、毎分約1ミリリットルでaCSFを循環させる。
ノーズピースを25回水浸漬対物レンズでイメージングチャンバ内に配置します。エピ蛍光光を用いて目的の標識細胞をスクリーニングし、目的の樹状突起を捕捉するように画像化体積を調整した。過飽和ピクセルと過飽和ピクセルの両方を識別するルックアップテーブルを使用して、ピクセルが過飽和にならないようにレーザー出力を調整します。
3Dイメージングボリュームを取得し、目的のフレームレートで取得を繰り返します。イメージングボリュームは、サンプルドリフトを補償するために各時点間で調整することができます。画像系列をインポートし、画像を時間単位で分割します。
すべてのタイムポイントを手動で保存するか、マクロプラグインを実行して保存します。正確な PSF を作成するには、[屈折 PSF 3D] をクリックして ImageJ プラグインを使用して理論上の点像分布関数を作成します。正確な PSF を作成するには、レンズの開口数、蛍光色素の放射波長、ピクセル サイズ、および Z 間隔が必要です。プラグイン、マクロを選択し、提供されているマクロを使用して、すべての時点に対してバッチ並列反復デコンボリューションを実行します。
デコンボリューションされたすべてのタイムポイントをスタックとしてインポートするには、ファイル、インポート、イメージシーケンスの順にクリックします。スタックをハイパースタックに変換するには、[画像]、[ハイパースタック]、[スタック]の順にクリックします。Zスライスと時間枠の数を追加し、正しい3Dドリフトプラグインを使用して3Dドリフトを修正します。
3D ドリフト補正されたハイパースタックを保存し、画像、ハイパースタック、ハイパースタックをクリックして画像を通常のスタックに変換し直し、画像、スタック、ツール、スタックスプリッターをクリックしてタイムポイントを分割します。分割するサブスタックの数には、タイムポイントの数を入力します。バッチ処理を使用して、すべての時点の最大投影法を作成します。
タイムラプス画像シーケンスを読み込むには、[ファイル]、[インポート]、[画像シーケンス]の順にクリックします。そして、従来のImageJツールを使用して、デコンボリングおよびポストプロセッシングされた2次元ビデオの所望の分析を行い、スターバースト細胞樹状突起を発達させる高解像度の3Dビデオを取得し、デコンボリングし、3Dドリフトについて補正した。Z平面最大投影は、樹状突起の微細化の領域と樹枝状の伸長の領域を示す、解析用の2Dビデオを作成するために生成されました。
各時点の3Dデコンボリューションは、ImageJによるデコンボリューションの前後に、単一のP6スターバーストアマクリンセルの微細な糸状体投影の分解能を増加させた。AAV感染期間の延長は、注射後5日および11日でのタンパク質発現の同様のレベルによって示されるように、必ずしも蛍光シグナルの増加をもたらさない。イメージング中のサンプルドリフトを低減することが重要です。
ドリフトは、一貫したイメージング温度を維持し、サンプル上の重量を適切に配置することによって最小限に抑えられます。ドリフトが発生した場合、時系列を手動で取得すると、フレーム間のイメージングボリュームを調整できます。これにより、対象のフィーチャがフレーム内に残ります。
このプロトコルは、発達中の神経突起の高解像度、デコンボレーション、およびドリフト補正された3Dビデオを生成します。このような映像は、ニューロン配線の理解を深めることにつながり、3次元形態形成の計算解析手法を進めるために必要とされています。神経突起発生の高スループット解析を実現するためには、より優れた自動トレースおよびトラッキングソフトウェアが必要です。
