Se requiere el etiquetado de una sola célula y la visualización de cenadores dendríticos o axonales para estudiar la morfogénesis neuronal. Al etiquetar los cenadores en desarrollo de una manera mínimamente invasiva, el tejido de la retina permanece sano y adecuado para imágenes vivas confocales prolongadas. La principal ventaja de este método es la capacidad de visualizar cenadores individuales con proteínas fluorescentes multicolores dentro de los cuatro días posteriores a la inyección.
Esto hace posible el estudio de las morfologías de los cenadores neonatales. Este protocolo de análisis e imágenes de inyección se puede utilizar para estudiar las morfologías neuronales en todo el sistema nervioso central. Se debe determinar la selección adecuada de Cre y la ubicación de la inyección para dirigirse a la población celular de interés.
Comience seleccionando una línea de ratón Cre para etiquetar las poblaciones de células de la retina de interés. Obtener el virus AAV dependiente de la recombinasa que codifica proteínas fluorescentes. Para un etiquetado óptimo de procesos finos, seleccione vectores que expresen proteínas fluorescentes modificadas dirigidas a la membrana plasmática.
Para la alícuota AAV en hielo, y prepare una dilución de uno a cuatro AAV usando solución salina estéril o PBS. Para visualizar las inyecciones, coloree la solución de azul agregando aproximadamente un microlitro de solución de colorante FCF 0.02% Fast Green por cada 15 microlitros de dilución AAV. Esterilizar el área de inyección con etanol al 70%.
Rellene la micropipeta con la dilución AAV con una microjeringa. Bajo un microscopio estereoscópico, rompa la punta de la micropipeta con una aguja de calibre 30 para desprecintar la punta. Después de anestesiar a los ratones neonatales, tatúe sus almohadillas de patas con tinta de tatuaje usando una aguja de calibre 30 para identificar a los animales.
Recolectar recortes de cola para el aislamiento del ADN y el genotipado. Frote la piel que recubre los ojos con 70% de etanol. Use una aguja de calibre 30 para abrir el párpado fusionado mientras aplica una ligera presión con los dedos para abrir el ojo.
Haga un pequeño agujero a través de la córnea en la unión de la córnea esclerótica. Inserte la micropipeta de vidrio en el orificio y presione el pedal del microinyector de dos a cuatro veces para inyectar el AAV en el espacio intravítreo. Retire lentamente la micropipeta y confirme la inyección de AAV visualizando el tinte azul en la pupila.
Después de preparar el aCSF retiniano como se describe en el manuscrito de texto, oxigene el aCSF retiniano burbujeando con carbógeno durante un mínimo de 15 minutos, luego ajuste el pH a 7.4. Incrustar una placa de Petri de 60 milímetros de diámetro en una bandeja de hielo y llenarla con aCSF retiniana oxigenada. Coloque la placa de Petri llena bajo un microscopio estereoscópico.
A continuación, corte el colgajo del párpado del ratón sacrificado para exponer el ojo. Use fórceps contundentes para enuclear los ojos y transferirlos al aCSF retiniano frío colocado debajo del microscopio estereoscópico. Bajo el microscopio estereoscópico, estabilice el ojo apretando el nervio óptico con el número cinco de Dumont y haga un agujero en el centro de la córnea con una aguja de calibre 30, luego inserte una punta de las micro tijeras en el orificio para hacer una incisión desde el orificio hasta el final de la córnea.
Repita para hacer cuatro rodajas en las direcciones cardinales, creando cuatro solapas. Agarre y separe los dos colgajos adyacentes, pelando suavemente la esclerótica de la retina para todos los colgajos de la córnea. Luego retire la lente de la copa de la retina con los fórceps.
Finalmente, use micro tijeras para hacer cuatro incisiones radiales desde el borde de la retina hacia el nervio óptico, creando cuatro pétalos iguales. Si utiliza filtros de membrana MCE grises de gran diámetro para el montaje, corte el disco en cuadrantes de aproximadamente un centímetro de ancho, luego coloque el disco MCE en el centro de un papel de filtro blanco más grande. Usando dos pinceles de tamaño tres por cero, voltee una taza de retina sobre un pincel con la célula ganglionar de la retina hacia abajo.
Levante suavemente la retina fuera del aCSF, asegurándose de que la tensión del agua no desgarre la retina. Mientras mantienes el pincel con la retina, mueve la placa de Petri que contiene aCSF fuera del camino y coloca el papel de filtro blanco con la membrana MCE debajo del estereoscopio. Usando una pipeta de transferencia, coloque una gota de aCSF en el centro del papel de filtro MCE.
Flote la retina en la gota de aCSF creada por la tensión superficial y la membrana MCE cargada. Use pinceles para colocar la retina dentro de la gota con la célula ganglionar retiniana hacia arriba, luego despliegue los cuatro pétalos. Una vez colocado, cree un puente de agua entre el pincel y el papel de filtro blanco para romper la tensión superficial de la gota.
Ensamble la cámara de incubación de imágenes en vivo y llénela con aCSF oxigenado. Encienda la bomba y el controlador de temperatura, asegurándose de que la temperatura no supere los 34 grados centígrados. La temperatura de la cámara puede tardar hasta una hora en estabilizarse.
Se recomienda configurar la cámara de incubación antes de comenzar la disección de la retina. La temperatura estable de la cámara ayuda a reducir la deriva de la muestra. Para transferir el montículo plano de retina a la cámara de perfusión, detenga la bomba y retire el aCSF que se encuentra en la cámara.
Luego coloque el disco MCE con el soporte plano de retina en la cámara de incubación. Moje previamente un peso de muestra para romper la tensión superficial, luego colóquelo en el soporte plano asegurándose de que el peso de la muestra se coloque en el papel MCE para reducir la deriva de la muestra. Rellene la cámara con el aCSF calentado y circule el aCSF a aproximadamente un mililitro por minuto.
Coloque la pieza nasal con el objetivo de inmersión de agua 25 veces en la cámara de imágenes. Detecte las células etiquetadas de interés utilizando luz epifluorescente y ajuste el volumen de la imagen para capturar las características dendríticas de interés. Usando una tabla de búsqueda que identifica píxeles sobresaturados e infrasaturados, ajuste la potencia del láser de modo que no haya píxeles sobresaturados.
Adquiera el volumen de imágenes 3D y repita la adquisición a la velocidad de fotogramas deseada. El volumen de la imagen se puede ajustar entre cada punto de tiempo para compensar la deriva de la muestra. Importe la serie de imágenes, dividiendo las imágenes por tiempo.
Guarde todos los puntos de tiempo manualmente o ejecutando un complemento de macro. Cree una función teórica de dispersión de puntos utilizando el complemento ImageJ haciendo clic en Defraction PSF 3D, se requiere apertura numérica de lente, longitud de onda de emisión de fluoróforos, tamaño de píxel y espaciado Z para crear un PSF preciso. Seleccione complementos, macros y ejecute para realizar una deconvolución iterativa paralela por lotes para todos los puntos de tiempo utilizando la macro proporcionada.
Importe todos los puntos de tiempo descontorneados como una pila haciendo clic en archivo, importar y, a continuación, en secuencia de imágenes. Convierta la pila en una hyperstack haciendo clic en image, hyperstacks y, a continuación, stacks to hyperstack. Agregue el número de Z-slices y marcos de tiempo, luego corrija la deriva 3D usando el complemento de deriva 3D correcto.
Guarde la hiperstack corregida de deriva 3D y convierta la imagen de nuevo en una pila normal haciendo clic en imagen, hyperstacks, hyperstack para apilar, luego divida los puntos de tiempo haciendo clic en imagen, pilas, herramientas y divisor de pilas. Para el número de substacks que se van a dividir, introduzca el número de puntos de tiempo. Utilice el procesamiento por lotes para crear una proyección máxima para todos los puntos de tiempo.
Importe la secuencia de imágenes de lapso de tiempo haciendo clic en archivo, importar y, a continuación, en secuencia de imágenes. Y utilice las herramientas convencionales de ImageJ para el análisis deseado de video bidimensional desconvolucionado y postprocesado, Un video 3D de alta resolución de desarrollo de dendritas de células starburst fue adquirido, desconvoluvido y corregido para la deriva 3D. Se produjeron proyecciones máximas de plano Z para hacer videos 2D para análisis, mostrando un área de refinamiento dendrítico y un área de crecimiento dendrítico.
La deconvolución 3D de cada punto de tiempo aumentó la resolución de las proyecciones de filopodia fina de una sola célula amacrina de estallido estelar P6 antes y después de la deconvolución con ImageJ. Los períodos prolongados de infección por AAV no necesariamente conducen a un aumento de la señal fluorescente, como lo demuestran los niveles similares de expresión de proteínas a los cinco y 11 días después de la inyección. Es importante reducir la deriva de la muestra durante la toma de imágenes.
La deriva se minimiza manteniendo una temperatura de imagen constante y posicionando adecuadamente el peso en la muestra. Si se produce una deriva, la adquisición manual de la serie temporal permite ajustar el volumen de imagen entre fotogramas. Esto asegura que las características de interés permanezcan en el marco.
Este protocolo produce videos 3D de alta resolución, descontormulados y corregidos por deriva de neuritas en desarrollo. Tales videos conducen a una mejor comprensión del cableado neuronal y son necesarios para avanzar en los métodos de análisis computacional de la morfogénesis 3D. Se requieren mejores softwares automáticos de rastreo y seguimiento para lograr un análisis de alto rendimiento del desarrollo de neuritas.
