والهدف من هذا البروتوكول هو تصور المجاميع heterochromatin في خلايا Drosophila. لتحقيق ذلك ، نستخدم خلايا البوليتين الموجودة في الغدد اللعابية ليرقات النجمة الثالثة يتم تضخيم جينوم هذه الخلايا ما يقرب من ألف مرة ، وتحافظ الكروموسومات على ميزات خلايا الواجهة. لديهم التيلوميرات محددة جيدا، والجسور تسمى chromocenter التي تجمع جميع centromeres، وانها أساسا غير لوني.
باستخدام أنسجة يرقات النجوم الثالثة ، اسمح لنا أيضا بتقييم التغيير في المجاميع غير اللونية في خلفية المسوخ الجينية المختلفة. لتحسين ثقافة يرقات النجوم الثالثة ، ستحتاج أولا إلى جمع البالغين من العمر 5 إلى 10 أيام ، ووضع حوالي 50 في زجاجة عنق واسعة من الوسائط القياسية. 25 ذكر و 25 أنثى.
ضع الزجاجة في حاضنة درجة حرارة خاضعة للرقابة عند 25 درجة مئوية لمدة 12 ساعة. بعد انتهاء فترة الحضانة، قم بإزالة البالغين ونقلهم إلى زجاجة جديدة لتكرار الإجراء. دع الأجنة تنمو عند 18 درجة مئوية لمدة 22 ساعة.
لجمع اليرقات ، تأكد من اختيار اليرقات الهائمة ، والتي ليس لديها كروية علنية. تشريح 15 زوجا من الغدد اللعابية، أو بقدر ما تستطيع في فترة 30 دقيقة في برنامج تلفزيوني الباردة مع مثبطات الاحتجاج تحت المجهر. نقل الغدد اللعابية إلى أنبوب آخر مع الجليد البارد PBS.
غسل مرة واحدة مع برنامج تلفزيوني الباردة بالإضافة إلى مثبطات الاحتجاجات. تذكر، انتظر دائما حتى يصل النسيج إلى أسفل الأنبوب. بعد إزالة برنامج تلفزيوني من الخطوة الأخيرة، إضافة مباشرة 0.5 ملليلتر من واحد X مجموعة تثبيت اللثة العازلة و 50٪ الميثانول بالإضافة إلى 2٪ الفورمالديهايد.
احتضان لمدة ساعتين في درجة مئوية أربع مع تناوب معتدل. نفذ غسيل دوران لمدة خمس دقائق مع مخزن Tris-Triton المؤقت ، مع إضافة ملليلتر واحد. انتظر دائما حتى يصل النسيج إلى أسفل الأنبوب.
ملاحظة: انتظر حتى يصل النسيج إلى أسفل الأنبوب. احتضان الغدد اللعابية مع تريس تريتون، نفس أعلاه، بالإضافة إلى 1٪ من بيتا ميركابتوثانول لمدة ساعتين في 37 درجة مئوية مع اهتزاز خفيف. اغسل مع مخزن BO3 العازل، واحتضن مع BO3 بالإضافة إلى 10 ملليمولار DTT في 37 درجة مئوية مع اهتزاز خفيف لمدة 15 دقيقة.
في نهاية فترة الحضانة، قم بإجراء غسلة مع ملليلتر واحد من العازلة BO3 وحدها. احتضان الغدد اللعابية في ملليلتر واحد من العازلة B لمدة ساعتين في درجة حرارة الغرفة مع التناوب. إزالة كافة المخزن المؤقت B وإضافة المخزن المؤقت A زائد الأجسام المضادة ذات الفائدة.
في هذه الحالة، نستخدم HP واحد، A C 1 8 9 من بنك إيريديوم. 1 في 3، 000 أكثر من ليلة في أربع درجات مع التناوب. عند هذه النقطة من المهم أن الهز لا يثير فقاعات، والتي قد تضر الأجسام المضادة.
إعطاء علاج من قبل 15 دقيقة يغسل مع العازلة B، تحت اثارة في درجة حرارة الغرفة باستخدام ملليمتر واحد في كل مرة. يتم نقل الغدد إلى العازلة B جنبا إلى جنب مع الزوجين المضادات الحيوية الثانوية إلى الكلمة الرجوع لمدة ساعتين، تحت التناوب في أربع درجات. في هذه الخطوة، من المهم تغطية الأنبوب بورق الألومنيوم لحماية الجسم المضاد الثانوي من الضوء.
قم بإجراء غسالات 2x15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة ، في حين أن الدوران مع ملليلتر واحد من B.Incubate العازلة مع علامة الحمض النووي مثل Sydox أو OH ، ويذوب في ملليلتر واحد من العازلة B لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة مع الدوران. قم بإجراء غسل واحد مع العازلة B ومرة واحدة مع PBS، كل غسل يدوم 10 دقائق، في حين تدور في درجة حرارة الغرفة. وأخيرا، جبل الغدد اللعابية على الشريحة، مما يجعل بركة مع زلة غطاء.
وضع الغدد اللعابية في منتصف حمام السباحة وتغطي مع Sidiflor. لتجنب تشوه الفقاعة ، وتوسيع السائل اللزج في كل مكان. ثم ختم جميع الشرائح مع طلاء الأظافر واضحة.
مراقبة تحت المجهر مضان أو confocal. إذا كانت العينة لن يتم ملاحظتها في نفس اليوم ، فقم بتخزينها من الضوء عند أربع درجات. تظهر النتائج التمثيلية لداء أحادي الكبد 1 في الغدد اللعابية Drosophila في الشكل الأول.
والنتيجة الإيجابية هي ملاحظة نقطة محورية واحدة كما هو الحال في A، أو تجميع لوني أثيري أو مكثفات. والنتيجة السلبية هي عدم وجود إشارة أو إشارة مشتتة. في بعض الأحيان ، يمكن ملاحظة إشارة مزدوجة مثل نقطة مزدوجة في C ، ولكن عادة ما تحدث بكميات أصغر.
لتحليل البيانات التي يمكن أن تمثل كرسم بياني شريطي ، مقارنة توزيع HP1 مع خلفيات متحولة مختلفة. على سبيل المثال، في الشكل الثاني، يمكننا أن نرى أن 98٪ من النوى تقدم توزيع نقطة واحدة. و2٪ من بؤرتين في النوع البري.
في متحولة، تغيرت النسبة، ووجود اثنين من بؤر زادت إلى 40٪الشكل الثالث يظهر ممثل تريميثيليشن ليسين 9H3 في أحادية. يؤدي إلى الغدد اللعابية Drosophila مراقبة نقطة محورية واحدة في B، انها نتيجة مواتية في المجموع اللوني أو المكثفات، يمكن أن ينظر إلى إشارة مزدوجة أو ثلاثية في C في مناسبة نادرة، ولكن بكميات صغيرة. في نهاية هذا البروتوكول، سوف تكون قادرة على رؤية المكثفات diachromatic من بروتين HP1 على الرغم من القيود المفروضة على الدولة، وسوف يكون النهج الأول جيدة.
