يمكن أن يساعد هذا البروتوكول الباحثين على فصل شبكية العين بسهولة للفئران ومراقبة التغيرات الديناميكية في الأوعية الدموية الشبكية لنموذج فأر OIR. المزايا الرئيسية لهذه الطريقة هي الحفاظ على سلامة شبكية العين المنفصلة والسماح لكل فأر بالعمل كعنصر تحكم خاص به ، مما يجعل النتائج أكثر قابلية للمقارنة. قد يكافح الباحثون الذين يجربون هذه الطريقة لأول مرة أثناء أخذ صور التوجيه الخمسة لأنه من الصعب بعض الشيء وضع الجراء في الموضع الصحيح.
لجمع الأنسجة لتركيب الشبكية بالكامل، استخدم مقص منحني لفصل مقل العيون عن النسيج المداري لجرو C57-Black/6 الرحيم. ثم أدخل ملقطا منحنيا في الجزء الخلفي من مقلة العين ، مع تثبيت العصب البصري ورفع العين بسرعة من المدار. ضع مقل العيون في PBS المبرد مسبقا لإزالة أي شعر ودم من السطح.
عندما يتم جمع جميع مقل العيون ، انقل مقل العيون النظيف إلى أنبوب طرد مركزي دقيق سعة مليلترين يحتوي على 4٪ بارافورمالديهايد ، واحتضنه لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة و 12 إلى 15 دورة في الدقيقة. في نهاية الحضانة ، أضف قطرة من PBS إلى مركز طبق ثقافة تحت مجهر تشريح ، وضع مقلة عين واحدة في القطرة. عند إمساك مقلة العين بزوج من الملقط ، استخدم إبرة حقنة سعة ملليلتر واحد لثقب القرنية بعناية في طرف القرنية.
أدخل طرف زوج من المقصات في الثقب ، واقطع القرنية على طول طرف القرنية ، مع الحرص على عدم قطع شبكية العين. استخدم الملقط لإزالة القزحية والعدسة، وضع كوب العين المتبقي في 4٪ بارافورمالديهايد لحضانة لمدة 45 دقيقة في درجة حرارة الغرفة على الخلاط. في نهاية الحضانة ، ضع كوب العين الثابت في قطرة جديدة من PBS في وسط طبق ثقافي جديد.
امسك كأس العين بزوج واحد من الملقط ، استخدم زوجا ثانيا من الملقط لفصل طبقات شبكية العين والصلبة بلطف. ضع طرف المقص بين طبقات الشبكية والصلبة ، واقطع الصلبة باتجاه العصب البصري. قشر الصلبة من شبكية العين للحصول على كوب الشبكية.
باستخدام الملقط ، حرر الاتصال بين الأوعية الهيالويد الشعاعية والشبكية المحيطية. استخدم ماصة سعة مليلترين مع قطع الطرف لنقل كوب الشبكية إلى بئر واحد من صفيحة 48 بئرا لمدة ثلاث غسلات لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة PBS على الخلاط. بعد الغسيل الأخير ، احتضن الكوب في 1٪ Triton X-100 و 5٪ مصل الحمير العادي في PBS بين عشية وضحاها عند أربع درجات مئوية.
لتسمية الأوعية الدموية في الشبكية بالإيزوليكتين B4 ، احتضن شبكية العين في بئر واحد من صفيحة 48 بئرا في 400 ميكرولتر 0.1٪ مصل حمار طبيعي مكمل بالإيزولوكتين B4-594 بين عشية وضحاها عند 4 درجات مئوية على شاكر. إذا لزم الأمر ، يمكن إضافة جسم مضاد أولي آخر في نفس الوقت. في اليوم التالي ، اغسل شبكية العين بثلاث غسلات لمدة 20 دقيقة بنسبة 0.1٪ PBST على الخلاط.
بعد الغسيل الأخير ، احتضن شبكية العين بجسم مضاد ثانوي مناسب عالي التقارب لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة قبل وضع علامة على العينة باستخدام DAPI لمدة 20 إلى 25 دقيقة. في نهاية الحضانة ، اغسل شبكية العين بثلاث غسلات لمدة 30 دقيقة في 0.1٪ PBST في درجة حرارة الغرفة مع الاهتزاز. بعد الغسل الأخير ، انقل كوب الشبكية إلى شريحة نظيفة مع توجيه الفتحة لأعلى ، واستخدم المجهر لقطع شبكية العين شعاعيا في مواضع الساعة الثالثة والسادسة والتاسعة و12 من المحيط نحو المركز ، حتى واحد إلى 1.5 ملم من رأس العصب البصري.
شطف شبكية العين ثلاث مرات مع بضع قطرات من PBS لكل غسل قبل استخدام الورق وضعت في الهواء لتجفيف وتسطيح الشبكية. أضف قطرة من وسط التركيب إلى وسط الغطاء حتى يغطي قطر القطيرة نصف الغطاء الانزلاقي. ثم ضع بسرعة الغطاء المتصاعد على الجانب المتوسط لأسفل على شبكية العين المنتشرة.
بمجرد إعداد جميع حوامل الشبكية المسطحة ، يمكن تصوير العينات بواسطة المجهر الفلوري البؤري. للتصوير في الجسم الحي ، أضف 20 ميكرولتر من قطرات العين التي لا تعد ولا تحصى لتحقيق توسع حدقة العين لفترة طويلة. بعد خمس دقائق ، ضع الجراء في وضع مستقر على وسادة تدفئة صغيرة أمام جهاز التصوير.
للحفاظ على الرطوبة في القرنيات، أضف بانتظام دموعا اصطناعية طوال عملية التصوير. بعد ذلك ، انقر فوق تصوير قاع العين بالأشعة تحت الحمراء على الجهاز لضبط رأس العصب البصري إلى وسط الشاشة. حقن داخل الصفاق 150 ميكرولتر من محلول ملح الصوديوم الفلوريسين بنسبة 0.5٪ ، وانقر على الفور فوق زري FA و Injection على لوحة اللمس في جهاز التصوير لبدء تشغيل المؤقت.
بعد ثلاث دقائق ، عندما تدخل الدورة الدموية للشبكية المرحلة الوريدية ، احصل على الصورة الأولى للشبكية المركزية. حرك عدسة جهاز التصوير أفقيا إلى الجانب الأنفي من العين حتى يقع رأس العصب البصري في منتصف جانب واحد من منطقة التقاط الصورة، والتقط الصورة الثانية. استمر في تحريك العدسة واحصل على صور للشبكية الصدغية والمتفوقة والسفلية بنفس الطريقة.
لمعالجة صور الشبكية في برنامج معالجة تصوير مناسب، افتح القائمة ملف وانقر فوق جديد لإنشاء لوحة قماشية جديدة بخلفية سوداء. افتح صورة الشبكية المركزية. ثم انقر فوق ملف لإضافة صورة ثانية.
اضبط عتامة الصورة الثانية إلى 60٪ وحرك الصورة وقم بتغيير حجمها حتى تتداخل الصورتان. انقر فوق التبديل بين أوضاع التحويل الحر والاعوجاج ، وقم بإجراء تعديلات دقيقة على الأوعية إذا لزم الأمر. ثم اضبط عتامة الصورة الثانية مرة أخرى على 100٪ حدد كلتا الصورتين، وانقر فوق طبقات المزج التلقائي.
حدد البانوراما كطريقة مزج، وحدد أيضا مربعات النغمات والألوان السلسة والمساحات الشفافة للتعبئة الواعية بالمحتوى. انقر فوق موافق لإكمال خياطة الصورتين الأوليين. بعد ذلك ، أضف الصورة الثالثة ، وقم بخياطة هذه الصورة إلى أول صورتين كما هو موضح حتى يتم خياطة جميع الصور الخمس من شبكية العين الواحدة.
عندما تتم معالجة جميع الصور من التحليل ، استخدم أداة المحاصيل لاقتصاص صور FFA إلى حجم موحد لتسهيل مراقبة التغيرات في ديناميكيات الأوعية الدموية في الشبكية في نقاط زمنية مختلفة للنمو. بعد خمسة أيام من التعرض لفرط التأكسج ، تظهر الشبكية المركزية للجراء بعد يوم ما بعد الولادة 12 منطقة كبيرة غير تروية. عند الانتقال إلى خمسة أيام من حالات نقص الأكسجة ، تصبح الشبكية تدريجيا وعيا وعائيا جديدا ، مما يدل على زيادة في إشارة التألق أقوى من تلك التي لوحظت في الأوعية الطبيعية المحيطة.
بعد يوم ما بعد الولادة 17 ، يتراجع الوليد الوعائي المرضي بسرعة وتظهر شبكية العين مظهرا طبيعيا تماما بحلول اليوم 25 بعد الولادة. يمكن تحقيق قابلية جيدة للتكرار والاستقرار لنموذج اعتلال الشبكية الناجم عن الأكسجين من خلال التحكم في حجم القمامة وزيادة الوزن بعد الولادة للجراء. كما لوحظ ، فإن طمس الأوعية الدموية عادة ما يبلغ ذروته في اليوم 12 بعد الولادة ويختفي في اليوم 25 بعد الولادة بينما يبلغ طمس الأوعية الدموية الجديدة ذروته في اليوم 17 بعد الولادة ويتراجع بحلول يوم ما بعد الولادة 25.
في يوم ما بعد الولادة 15 إلى 25 الفئران اعتلال الشبكية الناجم عن الأكسجين، يزيد قطر الأوعية الدموية في الشبكية ويصبح معذبا للغاية مقارنة بتلك التي لوحظت لشبكية العين لدى الفئران الطبيعية. يلعب الملقط الموجود في اليد اليسرى بشكل أساسي دورا داعما. احرص على عدم الضغط على مقلة العين ، والتي يمكن أن تشوهها أو تمزقها.
