このプロトコルは、研究者がマウスの網膜を簡単に分離し、OIRマウスモデルの網膜血管系の動的変化を観察するのに役立ちます。この方法の主な利点は、分離された網膜の完全性を維持し、各マウスがそれ自身のコントロールとして機能することを可能にし、その結果、結果をより比較可能にすることである。この方法を初めて試す研究者は、子犬を正しい位置に配置するのが少し難しいため、5つの向きのイメージングを行う際に苦労する可能性があります。
網膜全体の取り付けのために組織を収集するには、湾曲したはさみを使用して、安楽死させたC57-Black / 6子犬の眼窩組織から眼球を外します。次に、湾曲した鉗子を眼球の後部に挿入し、視神経を固定し、眼窩から目を素早く持ち上げます。眼球を予冷したPBSに入れて、表面から髪の毛や血液を取り除きます。
すべての眼球を採取したら、洗浄した眼球を4%パラホルムアルデヒドを含む2ミリリットルの微量遠心チューブに移し、室温で15分間、毎分12〜15回転インキュベートします。インキュベーションの最後に、解剖顕微鏡下で培養皿の中心にPBSを1滴加え、片方の眼球を滴に入れます。一対の鉗子で眼球を持ち、1ミリリットルの注射針を使用して角膜辺縁部の角膜を慎重に穿刺します。
はさみの先端を穿刺に挿入し、網膜を切らないように注意しながら角膜辺縁に沿って角膜を切ります。鉗子を使用して虹彩と水晶体を取り除き、残りのアイカップを4%パラホルムアルデヒドに入れて、シェーカーで室温で45分間インキュベートします。インキュベーションの最後に、固定アイカップを新しい培養皿の中央にあるPBSの新鮮な滴に入れます。
1対の鉗子でアイカップを保持し、2対目の鉗子を使用して網膜層と強膜層を穏やかに分離します。網膜層と強膜層の間にハサミの先端を置き、強膜を視神経に向かって切断します。網膜から強膜をはがして網膜カップを取得します。
鉗子を使用して、橈骨硝子体血管と末梢網膜との間の接続を解放します。先端を切り落とした2ミリリットルのピペットを使用して、網膜カップを48ウェルプレートの1ウェルに移し、シェーカーの室温PBSで5分間3回洗浄します。最後の洗浄後、カップを1%Triton X-100と5%通常のロバ血清でPBSで摂氏4度で一晩インキュベートします。
網膜血管系をイソレクチンB4で標識するには、48ウェルプレートの1ウェルで、イソレクチンB4-594を添加した400マイクロリットルの0.1%正常ロバ血清の1ウェルで、シェーカーで摂氏4度で一晩インキュベートします。必要に応じて、別の一次抗体を同時に添加することができます。翌日、シェーカーで0.1%PBSTで20分間3回洗浄して網膜を洗浄します。
最後の洗浄後、網膜を適切な高親和性二次抗体で室温で1時間インキュベートしてから、DAPIでサンプルを20〜25分間標識します。インキュベーションの終わりに、振とうしながら室温で0.1%PBSTで3回の30分間洗浄で網膜を洗浄する。最後の洗浄後、網膜カップを開口部を上に向けてきれいなスライドに移し、顕微鏡を使用して、視神経乳頭から最大1〜1.5ミリメートルの周辺から中心に向かって3、6、9、および12時の位置で網膜を放射状に切断します。
レチナを洗浄ごとに数滴のPBSで3回すすぎ、エアレイドペーパーを使用して網膜を乾燥させて平らにします。液滴の直径がカバーガラスの半分を覆うまで、カバーガラスの中央に封入剤を一滴加えます。次に、カバーガラス取り付け媒体側を下にして、広げた網膜にすばやく置きます。
すべての網膜フラットマウントが準備されたら、サンプルを共焦点蛍光顕微鏡でイメージングできます。in vivoイメージングの場合は、散瞳点眼薬を20マイクロリットル加えて、瞳孔拡張を長期間持続させます。5分後、イメージングデバイスの前の小さな加熱パッドの安定した位置に子犬を置きます。
角膜の水分を維持するために、イメージング手順全体を通して定期的に人工涙液を追加します。次に、デバイスの赤外線眼底イメージングをクリックして、視神経乳頭を画面の中央に調整します。150マイクロリットルの0.5%フルオレセインナトリウム塩溶液を腹腔内注射し、すぐにイメージングデバイスのタッチパネルにあるFAボタンと注入ボタンをクリックしてタイマーを開始します。
3分後、網膜の血液循環が静脈相に入ったら、中心網膜の最初の画像を取得します。視神経乳頭が画像取得領域の片側の中点に位置するまで、撮像装置のレンズを眼の鼻側に水平に動かし、第2の画像を撮影する。レンズを動かし続け、側頭網膜、上網膜、下網膜の画像を同じように取得します。
適切な画像処理プログラムで網膜画像を処理するには、[ファイル] メニューを開き、[新規作成] をクリックして、背景が黒の新しいキャンバスを作成します。網膜中心の画像を開きます。次に、[ファイル]をクリックして2番目の画像を追加します。
2番目の画像の不透明度を60%に調整し、2つの画像が重なるまで画像を移動およびサイズ変更します。自由変形モードとワープモードの切り替えをクリックし、必要に応じて船舶を微調整します。次に、2番目の画像の不透明度を100%両方の画像を選択し、[レイヤーの自動ブレンド]をクリックします。
ブレンド方法としてパノラマをチェックし、[シームレスなトーンと色]および[コンテンツ対応の塗りつぶし透明領域]のチェックボックスもオンにします。「OK」をクリックして、最初の 2 つの画像のスティッチングを完了します。次に、3 番目の画像を追加し、1 つの網膜からの 5 つの画像すべてがステッチされるまで、この画像を最初の 2 つの画像にステッチします。
分析からのすべての画像が処理されたら、切り抜きツールを使用してFFA画像を均一なサイズにトリミングし、さまざまな発生時点での網膜血管系動態の変化の観察を容易にします。高酸素症への5日間の曝露後、生後12日目の子犬の中心網膜は大きな非灌流領域を示します。5日間の低酸素状態に移行すると、網膜は徐々に新生血管になり、周囲の正常血管で観察されたものよりも強い蛍光シグナルの増加を示します。
生後17日目以降、病的新生血管は急速に退行し、網膜は生後25日目までに完全に正常な外観を示します。酸素誘発性網膜症モデルの良好な再現性と安定性は、子犬の同腹児サイズと出生後の体重増加を制御することによって達成できます。観察されたように、血管閉塞は通常、生後12日目にピークに達し、出生後25日目に消失しますが、新生血管形成は出生後17日目にピークに達し、出生後25日目までに退行します。
生後15〜25日目の酸素誘発網膜症マウスでは、網膜血管径が正常マウスの網膜で観察されたものと比較して増加し、非常に拷問的になります。左手の鉗子は主に補助的な役割を果たします。眼球を変形させたり破裂させたりする可能性のある眼球を絞らないように注意してください。
