Bu protokol, araştırmacıların farelerin retinalarını kolayca ayırmalarına ve OIR fare modelinin retina vaskülatüründeki dinamik değişiklikleri gözlemlemelerine yardımcı olabilir. Bu yöntemin temel avantajları, ayrılmış retinaların bütünlüğünün korunması ve her farenin kendi kontrolü olarak hizmet etmesine izin vermektir, bu da sonuçları daha karşılaştırılabilir hale getirir. Bu yöntemi ilk kez deneyen araştırmacılar, beş oryantasyon görüntülemesini yaparken zorlanabilirler, çünkü yavruları doğru pozisyona yerleştirmek biraz zordur.
Retinal tam montaj için dokuyu toplamak üzere, göz kürelerini ötenazi C57-Black / 6 yavrusunun yörünge dokusundan ayırmak için kavisli makas kullanın. Ardından, kavisli forsepsleri göz küresinin arka kısmına yerleştirin, optik siniri sıkıştırın ve gözü yörüngeden hızla kaldırın. Yüzeydeki kılları ve kanı çıkarmak için göz kürelerini önceden soğutulmuş PBS'ye yerleştirin.
Tüm göz küreleri toplandığında, temizlenen göz kürelerini% 4 paraformaldehit içeren iki mililitrelik bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın ve oda sıcaklığında 15 dakika ve dakikada 12 ila 15 devir boyunca inkübe edin. Kuluçkanın sonunda, diseksiyon mikroskobu altında bir kültür kabının ortasına bir damla PBS ekleyin ve damlaya bir göz küresi yerleştirin. Göz küresini bir çift forseps ile tutarak, kornea limbusunda korneayı dikkatlice delmek için bir mililitrelik bir şırınga iğnesi kullanın.
Bir çift makasın ucunu delinmeye yerleştirin ve retinayı kesmemeye dikkat ederek korneayı kornea limbus boyunca kesin. İris ve lensi çıkarmak için forseps kullanın ve kalan vizör adaptörünü, çalkalayıcı üzerindeki oda sıcaklığında 45 dakikalık bir inkübasyon için% 4 paraformaldehit içine yerleştirin. Kuluçkanın sonunda, sabit vizör adaptörünü yeni bir kültür kabının ortasındaki taze bir PBS damlasına yerleştirin.
Vizör adaptörünü bir çift forseps ile tutarak, retina ve sklera tabakalarını nazikçe ayırmak için ikinci bir çift forseps kullanın. Makasın ucunu retina ve sklera tabakaları arasına yerleştirin ve sklerayı optik sinire doğru kesin. Retina kabını elde etmek için sklerayı retinadan soyun.
Forseps kullanarak, radyal hyaloid damarlar ve periferik retina arasındaki bağlantıyı serbest bırakın. Retinal kabı, çalkalayıcı üzerindeki oda sıcaklığında PBS'de beş dakikalık üç yıkama için 48 delikli bir plakanın bir kuyucuğuna aktarmak için ucu kesilmiş iki mililitrelik bir pipet kullanın. Son yıkamadan sonra, bardağı% 1 Triton X-100 ve% 5 normal eşek serumunda PBS'de gece boyunca dört santigrat derecede inkübe edin.
Retinal vaskülatürü izolektin B4 ile etiketlemek için, retinayı 48 delikli bir plakanın bir kuyucuğunda, 400 mikrolitrede% 0.1 normal eşek serumunda, bir çalkalayıcı üzerinde 4 santigrat derecede gece boyunca izolektin B4-594 ile desteklenmiş normal eşek serumunda inkübe edin. Gerekirse, aynı anda başka bir birincil antikor eklenebilir. Ertesi gün, retinayı çalkalayıcıda% 0.1 PBST'de üç adet 20 dakikalık yıkama ile yıkayın.
Son yıkamadan sonra, numuneyi 20 ila 25 dakika boyunca DAPI ile etiketlemeden önce retinayı oda sıcaklığında bir saat boyunca uygun bir yüksek afiniteli ikincil antikor ile inkübe edin. Kuluçkanın sonunda, retinayı oda sıcaklığında% 0.1 PBST'de% 30 dakikalık üç yıkamayla çalkalayarak yıkayın. Son yıkamadan sonra, retina kabını açıklığı yukarı bakacak şekilde temiz bir slayta aktarın ve retinayı optik sinir kafasından bir ila 1,5 milimetreye kadar çevreden merkeze doğru saat üç, altı, dokuz ve 12 pozisyonlarında radyal olarak kesmek için mikroskopu kullanın.
Retinayı kurutmak ve düzleştirmek için hava yoluyla serilmiş kağıt kullanmadan önce retinayı yıkama başına birkaç damla PBS ile üç kez durulayın. Damlacığın çapı kapak kaymasının yarısını kaplayana kadar kapak kaymasının ortasına bir damla montaj ortamı ekleyin. Ardından, kapak kayması montajını orta taraftan aşağıya doğru hızla yayılmış retinanın üzerine yerleştirin.
Tüm retinal düz montajlar hazırlandıktan sonra, örnekler konfokal floresan mikroskopi ile görüntülenebilir. İn vivo görüntüleme için, uzun süreli göz bebeği genişlemesi elde etmek için 20 mikrolitre midriatik göz damlası ekleyin. Beş dakika sonra, yavruları görüntüleme cihazının önündeki küçük bir ısıtma yastığı üzerinde sabit bir konuma getirin.
Kornealardaki nemi korumak için, görüntüleme prosedürü boyunca düzenli olarak yapay gözyaşları ekleyin. Ardından, optik sinir kafasını ekranın ortasına ayarlamak için cihazdaki Kızılötesi Fundus Görüntüleme'ye tıklayın. İntraperitoneal olarak 150 mikrolitre% 0.5 floresein sodyum tuzu çözeltisi enjekte edin ve zamanlayıcıyı başlatmak için görüntüleme cihazının dokunmatik panelindeki FA ve Enjeksiyon düğmelerini hemen tıklayın.
Üç dakika sonra, retinanın kan dolaşımı venöz faza girdiğinde, merkezi retinanın ilk görüntüsünü elde edin. Optik sinir kafası görüntü alma alanının bir tarafının orta noktasına yerleştirilene kadar görüntüleme cihazının lensini yatay olarak gözün burun tarafına doğru hareket ettirin ve ikinci görüntüyü alın. Lensi hareket ettirmeye devam edin ve aynı şekilde zamansal, üst ve alt retinanın görüntülerini alın.
Retinal görüntüleri uygun bir görüntüleme işleme programında işlemek için, Dosya menüsünü açın ve siyah arka plana sahip yeni bir tuval oluşturmak için Yeni'yi tıklatın. Merkezi retinanın görüntüsünü açın. Ardından, ikinci bir görüntü eklemek için Dosya'yı tıklayın.
İkinci görüntünün opaklığını %60 olarak ayarlayın ve iki görüntü üst üste binene kadar görüntüyü taşıyın ve yeniden boyutlandırın. Serbest Dönüştürme ve Çarpıtma Modları Arasında Geçiş Yap'a tıklayın ve gerekirse gemilerde ince ayarlamalar yapın. Ardından ikinci görüntünün opaklığını tekrar %100'e ayarlayınHer iki görüntüyü de seçin ve Katmanları Otomatik Karıştır'ı tıklatın.
Karışım yöntemi olarak Panorama'yı işaretleyin ve ayrıca Kesintisiz Tonlar ve Renkler ve İçeriğe Duyarlı Dolgu Şeffaf Alanlar için kutuları işaretleyin. İlk iki görüntünün dikişini tamamlamak için Tamam'ı tıklatın. Ardından, üçüncü görüntüyü ekleyin ve tek bir retinadan gelen görüntülerin beşi de dikilinceye kadar gösterildiği gibi bu görüntüyü ilk iki görüntüye dikin.
Analizden elde edilen tüm görüntüler işlendiğinde, farklı gelişimsel zaman noktalarında retinal vaskülatür dinamiklerindeki değişikliklerin gözlemlenmesini kolaylaştırmak için FFA görüntülerini eşit bir boyuta kırpmak için Kırpma Aracı'nı kullanın. Hiperoksiye beş gün maruz kaldıktan sonra, doğum sonrası gün 12 yavrularının merkezi retinaları büyük bir perfüzyon dışı alan gösterir. Beş günlük hipoksik koşullara transfer edildikten sonra, retinalar yavaş yavaş neovaskülarize olur ve çevredeki normal damarlarda gözlenenden daha güçlü floresan sinyalinde bir artış gösterir.
Postnatal 17. günden sonra patolojik neovaskülarizasyon hızla geriler ve retina postnatal 25. güne kadar tamamen normal bir görünüm gösterir. Oksijen kaynaklı retinopati modelinin iyi bir tekrarlanabilirliği ve stabilitesi, yavruların çöp boyutunu ve doğum sonrası kilo alımını kontrol ederek elde edilebilir. Gözlemlendiği gibi, vazo-obliterasyon tipik olarak doğum sonrası 12. günde zirveye ulaşır ve doğum sonrası 25. günde kaybolurken, neovaskülarizasyon doğum sonrası 17. günde zirveye ulaşır ve doğum sonrası 25. günde geriler.
Doğum sonrası 15 ila 25 oksijene bağlı retinopati faresinde, retinal kan damarı çapı artar ve normal farelerin retinaları için gözlenenlere kıyasla oldukça işkenceci hale gelir. Sol eldeki forsepsler esas olarak destekleyici bir rol oynar. Göz küresini sıkmamaya dikkat edin, bu da onu deforme edebilir veya yırtabilir.
