ניטור צמיחה דינמית של כלי רשתית במודל עכבר רטינופתיה המושרה על ידי חמצן

פרוטוקול זה יכול לסייע לחוקרים להפריד בקלות את הרשתיות של עכברים ולבחון את השינויים הדינמיים בכלי הדם ברשתית של מודל עכבר OIR. היתרונות העיקריים של שיטה זו הם שימור שלמות הרשתיות המופרדות ומתן אפשרות לכל עכבר לשמש כבקרה משלו, מה שהופך את התוצאות להשוואה יותר. חוקרים שמנסים את השיטה הזו בפעם הראשונה עשויים להתקשות בזמן שהם לוקחים את חמש הדמיות האוריינטציה מכיוון שקצת קשה למקם את הגורים בתנוחה הנכונה.

כדי לאסוף את הרקמה להרכבה מלאה של הרשתית, השתמש במספריים מעוקלים כדי לנתק את גלגלי העיניים מהרקמה המסלולית של גור C57-Black/6 שעבר המתת חסד. לאחר מכן, הכנס מלקחיים מעוקלים לחלק האחורי של גלגל העין, הידוק עצב הראייה והרמת העין במהירות מהמסלול. הניחו את גלגלי העיניים ב-PBS מקורר מראש כדי להסיר שיער ודם מפני השטח.

לאחר שכל גלגלי העיניים נאספו, העבירו את גלגלי העיניים המנוקים לצינור מיקרוצנטריפוגה של שני מיליליטר המכיל 4% פרפורמלדהיד, ודגרו במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר ו-12 עד 15 סיבובים לדקה. בסוף הדגירה, הוסיפו טיפה של PBS למרכז צלחת תרבית תחת מיקרוסקופ מנתח, והכניסו גלגל עין אחד לתוך הטיפה. מחזיק את גלגל העין עם זוג מלקחיים, להשתמש מחט מזרק של מיליליטר אחד כדי לנקב בזהירות את הקרנית בלימבוס הקרנית.

הכנס את הקצה של זוג מספריים לתוך לנקב, לחתוך את הקרנית לאורך לימבוס הקרנית, נזהר לא לחתוך את הרשתית. השתמשו במלקחיים כדי להסיר את הקשתית והעדשה, והניחו את שארית העינית ב-4% פרפורמלדהיד לדגירה של 45 דקות בטמפרטורת החדר על השייקר. בסוף הדגירה, הניחו את העין הקבועה בטיפה טרייה של PBS במרכז מנת תרבות חדשה.

החזיקו את העין עם זוג מלקחיים אחד, השתמשו בזוג מלקחיים שני כדי להפריד בעדינות את שכבות הרשתית והסקלרה. מניחים את קצה המספריים בין שכבות הרשתית והסקלרה, וחותכים את הסקלרה לכיוון עצב הראייה. יש לקלף את הסקלרה מהרשתית כדי לקבל את הרשתית.

באמצעות מלקחיים, לשחרר את החיבור בין כלי hyaloid רדיאלי ורשתית היקפית. השתמשו בפיפטה של שני מיליליטר כשהקצה חתוך כדי להעביר את הרשתית לבאר אחת של צלחת של 48 בארות לשלוש שטיפות של חמש דקות בטמפרטורת החדר PBS על השייקר. לאחר הכביסה האחרונה, יש לדגום את הגביע ב-1% טריטון X-100 ו-5% סרום חמורים רגיל ב-PBS למשך הלילה בארבע מעלות צלזיוס.

כדי לסמן את כלי הדם ברשתית עם איזולקטין B4, יש לדגור את הרשתית בבאר אחת של צלחת 48 באר ב-400 מיקרוליטרים 0.1% סרום חמורים רגיל בתוספת איזולקטין B4-594 למשך הלילה בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס על שייקר. במידת הצורך, ניתן להוסיף נוגדן ראשוני נוסף בו זמנית. ביום שלמחרת, יש לשטוף את הרשתית עם שלוש שטיפות של 20 דקות ב-0.1% PBST על השייקר.

לאחר הכביסה האחרונה, לדגור על הרשתית עם נוגדן משני מתאים בעל זיקה גבוהה למשך שעה אחת בטמפרטורת החדר לפני תיוג הדגימה עם DAPI למשך 20 עד 25 דקות. בסוף הדגירה, שטפו את הרשתית בשלוש כביסות של 30 דקות ב-0.1% PBST בטמפרטורת החדר עם רעידות. לאחר השטיפה האחרונה, העבירו את הרשתית למגלשה נקייה כשהפתח פונה כלפי מעלה, והשתמשו במיקרוסקופ כדי לחתוך את הרשתית באופן רדיאלי בתנוחות שלוש, שש, תשע ו-12 מהפריפריה לכיוון המרכז, עד 1 עד 1.5 מילימטרים מראש עצב הראייה.

שטפו את הרשתית שלוש פעמים עם כמה טיפות של PBS בכל שטיפה לפני שתשתמשו בנייר מונחה באוויר לייבוש ושיטוח הרשתית. הוסיפו טיפה של מדיום הרכבה למרכז הכיסוי עד שקוטר הטיפה מכסה מחצית ממכסה את הכיסוי. לאחר מכן הניחו במהירות את החלק הבינוני של הכיסוי על הרשתית החיצונית.

לאחר הכנת כל התושבות השטוחות של הרשתית, ניתן לדמות את הדגימות על ידי מיקרוסקופיה פלואורסצנטית קונפוקלית. להדמיית in vivo, הוסיפו 20 מיקרוליטרים של טיפות עיניים מידריאטיות כדי להשיג התרחבות אישונים לאורך זמן. לאחר חמש דקות, הניחו את הגורים בתנוחה יציבה על כרית חימום קטנה מול מכשיר ההדמיה.

כדי לשמור על הלחות בקרניות, יש להוסיף באופן קבוע קרעים מלאכותיים לאורך הליך ההדמיה. לאחר מכן, לחץ על הדמיית פונדוס אינפרא אדום במכשיר כדי להתאים את ראש עצב הראייה למרכז המסך. הזרקת 150 מיקרוליטר של תמיסת מלח נתרן 0.5% פלואורסצין, ולחץ מיד על לחצני FA והזרקה בלוח המגע של מכשיר ההדמיה כדי להפעיל את הטיימר.

לאחר שלוש דקות, כאשר זרימת הדם של הרשתית נכנסה לשלב הוורידי, לרכוש את התמונה הראשונה של הרשתית המרכזית. הזז את עדשת מכשיר ההדמיה אופקית לצד האף של העין עד שראש עצב הראייה ממוקם בנקודת האמצע של צד אחד של אזור רכישת התמונה, וצלם את התמונה השנייה. המשך להזיז את העדשה ולקבל תמונות של הרשתית הטמפורלית, העליונה והנחותה באותו אופן.

לעיבוד תמונות הרשתית בתוכנית עיבוד הדמיה מתאימה, פתחו את התפריט 'קובץ' ולחצו על 'חדש' ליצירת בד ציור חדש עם רקע שחור. פתח את התמונה של הרשתית המרכזית. לאחר מכן לחץ על קובץ כדי להוסיף תמונה שנייה.

התאימו את אטימות התמונה השנייה ל-60%, הזיזו את התמונה ושנו את גודלה עד ששתי התמונות יחפפו. לחצו על 'עבור בין מצבי שינוי צורה חופשי' ו'עיקום', ובצעו התאמות עדינות בכלי הדם במידת הצורך. לאחר מכן החזירו את האטימות של התמונה השנייה ל- 100% בחרו בשתי התמונות, ולחצו על 'מיזוג שכבות אוטומטי'.

סמן את פנורמה כשיטת המיזוג, וסמן גם את התיבות עבור גוונים וצבעים חלקים ומילוי מודע לתוכן אזורים שקופים. לחץ על אישור כדי להשלים את התפירה של שתי התמונות הראשונות. לאחר מכן, הוסף את התמונה השלישית, ותפור תמונה זו לשתי התמונות הראשונות כפי שהודגם עד שכל חמש התמונות מרשתית אחת נתפרו.

לאחר עיבוד כל התמונות מניתוח, השתמש בכלי החיתוך כדי לחתוך את תמונות ה- FFA לגודל אחיד כדי להקל על התצפית על השינויים בדינמיקה של כלי הדם ברשתית בנקודות זמן התפתחותיות שונות. לאחר חמישה ימים של חשיפה להיפרוקסיה, הרשתיות המרכזיות של גורים לאחר יום 12 מדגימות אזור גדול ללא זילוף. עם המעבר לחמישה ימים של תנאים היפוקסיים, הרשתיות בהדרגה neovascularize, מראה עלייה באות פלואורסצנטי חזק יותר מזה שנצפה בכלי הדם הרגילים שמסביב.

לאחר יום 17 לאחר הלידה, הניאו-וסקולריזציה הפתולוגית נסוגה במהירות והרשתית מדגימה מראה נורמלי לחלוטין ביום 25 שלאחר הלידה. ניתן להשיג חזרה טובה ויציבות של מודל רטינופתיה המושרה על ידי חמצן על ידי שליטה בגודל ההמלטה ועלייה במשקל לאחר הלידה של הגורים. כפי שנצפה, הכחדת כלי הדם מגיעה לשיאה בדרך כלל ביום 12 שלאחר הלידה ונעלמת ביום 25 שלאחר הלידה, בעוד שהניאו-וסקולריזציה מגיעה לשיאה ביום 17 שלאחר הלידה ונסוגה ביום 25 שלאחר הלידה.

ביום שלאחר הלידה 15 עד 25 עכברי רטינופתיה המושרה על ידי חמצן, קוטר כלי הדם ברשתית עולה ונעשה מייסר מאוד בהשוואה לזה שנצפה עבור הרשתיות של עכברים רגילים. המלקחיים ביד שמאל משחקים בעיקר בתפקיד תומך. היזהר לא לסחוט את גלגל העין, אשר יכול לעוות או לקרוע אותו.