Этот протокол может помочь исследователям легко отделить сетчатку мышей и наблюдать динамические изменения в сосудистой системе сетчатки мышиной модели OIR. Основными преимуществами этого метода являются сохранение целостности отделенных сетчаток и возможность каждой мыши служить своим собственным контролем, что делает результаты более сопоставимыми. Исследователи, впервые попробовавшие этот метод, могут испытывать трудности при получении пяти ориентационных изображений, потому что немного трудно поместить детенышей в правильное положение.
Чтобы собрать ткань для крепления всей сетчатки, используйте изогнутые ножницы, чтобы отсоединить глазные яблоки от орбитальной ткани усыпленного щенка C57-Black/6. Затем вставьте изогнутые щипцы в заднюю часть глазного яблока, зажав зрительный нерв и быстро подняв глаз с орбиты. Поместите глазные яблоки в предварительно охлажденный PBS, чтобы удалить волосы и кровь с поверхности.
Когда все глазные яблоки будут собраны, перенесите очищенные глазные яблоки в двухмиллилитровую микроцентрифужную трубку, содержащую 4% параформальдегида, и инкубируйте в течение 15 минут при комнатной температуре и от 12 до 15 оборотов в минуту. В конце инкубации добавьте каплю PBS в центр чашки культуры под рассекающим микроскопом и поместите одно глазное яблоко в каплю. Удерживая глазное яблоко парой щипцов, используйте иглу шприца в один миллилитр, чтобы аккуратно проколоть роговицу в лимбе роговицы.
Вставьте кончик ножниц в прокол и срежьте роговицу вдоль лимбуса роговицы, стараясь не разрезать сетчатку. Используйте щипцы, чтобы удалить радужную оболочку и хрусталик, а оставшийся глазник поместить в 4% параформальдегид для 45-минутной инкубации при комнатной температуре на шейкере. В конце инкубации поместите неподвижный наглазник в свежую каплю PBS в центр нового блюда культуры.
Удерживая наглаз одной парой щипцов, используйте вторую пару щипцов, чтобы аккуратно разделить слои сетчатки и склеры. Поместите кончик ножниц между слоями сетчатки и склеры и разрезайте склеру по направлению к зрительному нерву. Очистите склеру от сетчатки, чтобы получить чашечку сетчатки.
С помощью щипцов освобождают связь между радиальными гиалоидными сосудами и периферической сетчаткой. Используйте двухмиллилитровую пипетку с отрезанным наконечником, чтобы перенести чашку сетчатки в одну лунку из 48-луночной пластины для трех пятиминутных промывок при комнатной температуре PBS на шейкере. После последней стирки высиживают чашку в 1% Triton X-100 и 5% нормальной ослиной сыворотке в PBS на ночь при четырех градусах Цельсия.
Чтобы маркировать сосудистую сетчатку изолектином B4, инкубируйте сетчатку в одной лунке 48-луночной пластины в 400 микролитров 0,1% нормальной ослиной сыворотки, дополненной изолектином B4-594 на ночь при 4 градусах Цельсия на шейкере. При необходимости одновременно может быть добавлено еще одно первичное антитело. На следующий день промыть сетчатку тремя 20-минутными промываниями в 0,1% PBST на шейкере.
После последней промывки инкубируют сетчатку с соответствующим высокоаффинным вторичным антителом в течение одного часа при комнатной температуре, прежде чем маркировать образец DAPI в течение 20-25 минут. В конце инкубации промыть сетчатку тремя 30-минутными промываниями в 0,1% ПБСТ при комнатной температуре с встряхиванием. После последней промывки перенесите чашку сетчатки на чистый слайд с отверстием, обращенным вверх, и используйте микроскоп, чтобы разрезать сетчатку радиально в трех, шести, девяти и 12-часовых положениях от периферии к центру, до одного до 1,5 миллиметра от головки зрительного нерва.
Промыть сетчатку три раза несколькими каплями PBS за одно стирку перед использованием бумаги, уложенной воздухом, чтобы высушить и сплющить сетчатку. Добавьте каплю монтажной среды к центру крышки до тех пор, пока диаметр капли не покроет половину крышки. Затем быстро поместите крышку, крепежную среднюю стороной вниз, на сетчатку с распростертым покрытием.
После того, как все плоские крепления сетчатки были подготовлены, образцы могут быть визуализированы с помощью конфокальной флуоресцентной микроскопии. Для визуализации in vivo добавьте 20 микролитров мидриатических глазных капель для достижения длительного расширения зрачка. Через пять минут поместите детенышей в стабильное положение на небольшую грелку перед устройством визуализации.
Чтобы сохранить влагу в роговице, регулярно добавляйте искусственные слезы на протяжении всей процедуры визуализации. Затем нажмите Инфракрасное изображение глазного дна на устройстве, чтобы настроить головку зрительного нерва в центр экрана. Внутрибрюшинно вводят 150 микролитров 0,5% флуоресцеина раствора натриевой соли и сразу же нажимают кнопки FA и Injection на сенсорной панели устройства визуализации, чтобы запустить таймер.
Через три минуты, когда кровообращение сетчатки вошло в венозную фазу, приобретите первое изображение центральной сетчатки. Переместите линзу устройства визуализации горизонтально к носовой стороне глаза, пока головка зрительного нерва не будет расположена в средней точке одной стороны области получения изображения, и сделайте второе изображение. Продолжайте двигать хрусталиком и получать изображения височной, верхней и нижней сетчатки таким же образом.
Чтобы обработать изображения сетчатки в соответствующей программе обработки изображений, откройте меню Файл и нажмите кнопку Создать, чтобы создать новый холст с черным фоном. Откройте изображение центральной сетчатки. Затем нажмите Файл, чтобы добавить второе изображение.
Отрегулируйте непрозрачность второго изображения до 60%, перемещайте и изменяйте размер изображения до тех пор, пока два изображения не будут перекрываться. Нажмите «Переключаться между режимами свободного преобразования» и «Деформация» и при необходимости внесите тонкие коррективы в сосуды. Затем установите для параметра непрозрачность второго изображения значение 100%Выберите оба изображения и нажмите кнопку «Автоматическое наложение слоев».
Установите флажок Панорама в качестве метода наложения, а также установите флажки Бесшовные тона и Цвета и Прозрачные области заливки с учетом содержимого. Нажмите кнопку ОК, чтобы завершить сшивание первых двух изображений. Затем добавьте третье изображение и сложите это изображение к первым двум изображениям, как показано до тех пор, пока все пять изображений с одной сетчатки не будут сшиты.
Когда все изображения из анализа будут обработаны, используйте инструмент обрезки, чтобы обрезать изображения FFA до однородного размера, чтобы облегчить наблюдение за изменениями в динамике сосудистой системы сетчатки в разных точках времени развития. После пяти дней воздействия гипероксии центральные сетчатки послеродовых щенков 12-го дня демонстрируют большую неперфузионную площадь. При переходе на пять дней гипоксических состояний сетчатка постепенно неоваскуляризируется, проявляя увеличение сигнала флуоресценции сильнее, чем наблюдаемое в окружающих нормальных сосудах.
После 17-го послеродового дня патологическая неоваскуляризация быстро регрессирует и к 25-му дню сетчатка демонстрирует совершенно нормальный внешний вид. Хорошая повторяемость и стабильность модели ретинопатии, индуцированной кислородом, может быть достигнута путем контроля размера помета и постнатального увеличения веса щенков. Как уже отмечалось, вазооблитерация обычно достигает пика на 12-й послеродовой день и исчезает на 25-й послеродовой день, в то время как неоваскуляризация достигает пика на 17-й послеродовой день и регрессирует к 25-му послеродовому дню.
В постнатальный день от 15 до 25 кислородно-индуцированных мышей с ретинопатией диаметр кровеносных сосудов сетчатки увеличивается и становится очень мучительным по сравнению с тем, что наблюдалось у сетчатки нормальных мышей. Щипцы в левой руке в основном играют вспомогательную роль. Следите за тем, чтобы не сдавить глазное яблоко, которое может деформировать или разорвать его.
