Überwachung des dynamischen Wachstums von Netzhautgefäßen im sauerstoffinduzierten Retinopathie-Mausmodell

Dieses Protokoll kann Forschern helfen, die Netzhaut von Mäusen leicht zu trennen und die dynamischen Veränderungen im Netzhautgefäßsystem des OIR-Mausmodells zu beobachten. Die Hauptvorteile dieser Methode sind die Erhaltung der Integrität der abgetrennten Netzhaut und die Möglichkeit, dass jede Maus als eigene Kontrolle dienen kann, was die Ergebnisse vergleichbarer macht. Forscher, die diese Methode zum ersten Mal ausprobieren, können bei der Aufnahme der fünf Orientierungsbilder Schwierigkeiten haben, da es etwas schwierig ist, Welpen in die richtige Position zu bringen.

Um das Gewebe für die gesamte Netzhautmontage zu sammeln, trennen Sie die Augäpfel mit einer gebogenen Schere vom Orbitalgewebe eines eingeschläferten C57-Black/6-Welpen. Führen Sie dann gekrümmte Pinzetten in den hinteren Teil des Augapfels ein, klemmen Sie den Sehnerv und heben Sie das Auge schnell aus der Augenhöhle. Legen Sie die Augäpfel in vorgekühltes PBS, um Haare und Blut von der Oberfläche zu entfernen.

Wenn alle Augäpfel gesammelt wurden, geben Sie die gereinigten Augäpfel in ein Zwei-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen, das 4% Paraformaldehyd enthält, und inkubieren Sie für 15 Minuten bei Raumtemperatur und 12 bis 15 Umdrehungen pro Minute. Fügen Sie am Ende der Inkubation einen Tropfen PBS in die Mitte einer Kulturschale unter einem Seziermikroskop hinzu und legen Sie einen Augapfel in den Tropfen. Halten Sie den Augapfel mit einer Pinzette fest und verwenden Sie eine Ein-Milliliter-Spritzennadel, um die Hornhaut am Hornhautlimbus vorsichtig zu punktieren.

Führen Sie die Spitze einer Schere in die Punktion ein und schneiden Sie die Hornhaut entlang des Hornhautlimbus, wobei Sie darauf achten, die Netzhaut nicht zu schneiden. Verwenden Sie eine Pinzette, um die Iris und die Linse zu entfernen, und legen Sie die verbleibende Augenmuschel in 4% Paraformaldehyd für eine 45-minütige Inkubation bei Raumtemperatur auf den Shaker. Am Ende der Inkubation legen Sie die feste Augenmuschel in einen frischen Tropfen PBS in der Mitte einer neuen Kulturschale.

Halten Sie die Augenmuschel mit einer Pinzette und verwenden Sie eine zweite Pinzette, um die Netzhaut- und Skleraschichten sanft zu trennen. Legen Sie die Spitze der Schere zwischen die Netzhaut und die Skleraschichten und schneiden Sie die Sklera in Richtung Sehnerv. Ziehen Sie die Sklera von der Netzhaut ab, um die Netzhautschale zu erhalten.

Lösen Sie mit einer Pinzette die Verbindung zwischen den radialen hyaloidalen Gefäßen und der peripheren Netzhaut. Verwenden Sie eine Zwei-Milliliter-Pipette mit abgeschnittener Spitze, um den Netzhautbecher in eine Vertiefung einer 48-Well-Platte für drei fünfminütige Wäschen bei Raumtemperatur PBS auf dem Shaker zu überführen. Nach dem letzten Waschgang den Becher in 1% Triton X-100 und 5% normalem Eselserum in PBS über Nacht bei vier Grad Celsius inkubieren.

Um das retinale Gefäßsystem mit Isolectin B4 zu markieren, inkubieren Sie die Netzhaut in einer Vertiefung einer 48-Well-Platte in 400 Mikrolitern 0,1% normalem Eselserum, ergänzt mit Isolectin B4-594, über Nacht bei 4 Grad Celsius auf einem Shaker. Bei Bedarf kann gleichzeitig ein weiterer primärer Antikörper zugegeben werden. Am nächsten Tag waschen Sie die Netzhaut mit drei 20-minütigen Wäschen in 0,1% PBST auf dem Shaker.

Nach dem letzten Waschgang inkubieren Sie die Netzhaut mit einem geeigneten hochaffinen sekundären Antikörper für eine Stunde bei Raumtemperatur, bevor Sie die Probe für 20 bis 25 Minuten mit DAPI markieren. Am Ende der Inkubation waschen Sie die Netzhaut mit drei 30-minütigen Wäschen in 0,1% PBST bei Raumtemperatur mit Schütteln. Nach der letzten Wäsche den Netzhautbecher mit der Öffnung nach oben auf einen sauberen Objektträger geben und die Netzhaut mit dem Mikroskop radial an den Positionen drei, sechs, neun und 12 Uhr von der Peripherie in Richtung Mitte schneiden, bis zu einem bis 1,5 Millimeter vom Sehnervenkopf entfernt.

Spülen Sie die Netzhaut dreimal mit ein paar Tropfen PBS pro Waschgang, bevor Sie mit luftgelegtem Papier die Netzhaut trocknen und glätten. Fügen Sie einen Tropfen Montagemedium in die Mitte des Deckglases hinzu, bis der Durchmesser des Tröpfchens die Hälfte des Deckglases bedeckt. Legen Sie dann schnell das Deckglas, das mit der mittleren Seite nach unten montiert wird, auf die ausgebreitete Netzhaut.

Sobald alle Netzhaut-Flachhalterungen vorbereitet sind, können die Proben durch konfokale Fluoreszenzmikroskopie abgebildet werden. Für die In-vivo-Bildgebung fügen Sie 20 Mikroliter mydriatische Augentropfen hinzu, um eine lang anhaltende Pupillenerweiterung zu erreichen. Nach fünf Minuten legen Sie die Welpen in eine stabile Position auf einem kleinen Heizkissen vor dem Bildgebungsgerät.

Um die Feuchtigkeit in den Hornhäuten zu erhalten, fügen Sie während des Bildgebungsverfahrens regelmäßig künstliche Tränen hinzu. Klicken Sie anschließend auf Infrarot-Fundusbildgebung auf dem Gerät, um den Sehnervkopf in die Mitte des Bildschirms einzustellen. Injizieren Sie intraperitoneal 150 Mikroliter 0,5% Fluorescein-Natriumsalzlösung und klicken Sie sofort auf die FA- und Injektionstasten auf dem Touchpanel des Bildgebungsgeräts, um den Timer zu starten.

Nach drei Minuten, wenn die Durchblutung der Netzhaut in die venöse Phase eingetreten ist, erhalten Sie das erste Bild der zentralen Netzhaut. Bewegen Sie die Linse des Bildgebungsgeräts horizontal zur nasalen Seite des Auges, bis sich der Sehnervenkopf in der Mitte einer Seite des Bildaufnahmebereichs befindet, und nehmen Sie das zweite Bild auf. Bewegen Sie das Objektiv weiter und nehmen Sie Bilder der temporalen, oberen und unteren Netzhaut auf die gleiche Weise auf.

Um die Netzhautbilder in einem geeigneten Bildbearbeitungsprogramm zu verarbeiten, öffnen Sie das Menü Datei und klicken Sie auf Neu, um eine neue Leinwand mit schwarzem Hintergrund zu erstellen. Öffnen Sie das Bild der zentralen Netzhaut. Klicken Sie dann auf Datei, um ein zweites Bild hinzuzufügen.

Stellen Sie die Deckkraft des zweiten Bildes auf 60% ein und verschieben und skalieren Sie das Bild, bis sich die beiden Bilder überlappen. Klicken Sie auf Zwischen freiem Transformations- und Warp-Modus wechseln und nehmen Sie bei Bedarf subtile Anpassungen an den Gefäßen vor. Stellen Sie dann die Deckkraft des zweiten Bildes wieder auf 100 % einWählen Sie beide Bilder aus und klicken Sie auf Ebenen automatisch überblenden.

Aktivieren Sie Panorama als Mischmethode und aktivieren Sie auch die Kontrollkästchen für Nahtlose Töne und Farben und inhaltsbewusste Fülltransparentbereiche. Klicken Sie auf OK, um das Zusammenfügen der ersten beiden Bilder abzuschließen. Fügen Sie als Nächstes das dritte Bild hinzu und fügen Sie dieses Bild wie gezeigt zu den ersten beiden Bildern zusammen, bis alle fünf Bilder von einer einzelnen Netzhaut zusammengefügt wurden.

Wenn alle Bilder aus der Analyse verarbeitet wurden, verwenden Sie das Zuschneidewerkzeug, um die FFA-Bilder auf eine einheitliche Größe zuzuschneiden, um die Beobachtung der Veränderungen der retinalen Gefäßdynamik zu verschiedenen Entwicklungszeitpunkten zu erleichtern. Nach fünf Tagen Exposition gegenüber Hyperoxie zeigen die zentralen Netzhäute der postnatalen Welpen des 12. Tages einen großen Nicht-Perfusionsbereich. Nach dem Übergang zu fünf Tagen hypoxischer Bedingungen neovaskularisieren die Netzhäute allmählich und zeigen einen Anstieg des Fluoreszenzsignals, der stärker ist als in den umgebenden normalen Gefäßen.

Nach dem postnatalen Tag 17 bildet sich die pathologische Neovaskularisation schnell zurück und die Netzhaut zeigt am postnatalen Tag 25 ein völlig normales Aussehen. Eine gute Wiederholbarkeit und Stabilität des sauerstoffinduzierten Retinopathiemodells kann durch die Kontrolle der Wurfgröße und der postnatalen Gewichtszunahme der Welpen erreicht werden. Wie beobachtet, erreicht die Vasobliteration typischerweise am postnatalen Tag 12 ihren Höhepunkt und verschwindet am postnatalen Tag 25, während die Neovaskularisation am postnatalen Tag 17 ihren Höhepunkt erreicht und sich am postnatalen Tag 25 zurückbildet.

Bei postnatalen Mäusen am 15. bis 25. Tag der Sauerstoff-induzierten Retinopathie nimmt der Durchmesser der retinalen Blutgefäße zu und wird im Vergleich zu der Netzhaut normaler Mäuse stark quälend. Die Pinzette in der linken Hand spielt hauptsächlich eine unterstützende Rolle. Achten Sie darauf, den Augapfel nicht zu quetschen, da er sich verformen oder reißen kann.