이 프로토콜은 연구자들이 마우스의 망막을 쉽게 분리하고 OIR 마우스 모델의 망막 혈관계의 동적 변화를 관찰하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 방법의 주요 장점은 분리 된 망막의 무결성을 보존하고 각 마우스가 자체 제어 역할을하도록하여 결과를보다 비교할 수 있다는 것입니다. 이 방법을 처음 시도하는 연구원은 새끼를 올바른 위치에 배치하기가 약간 어렵 기 때문에 5 가지 방향 이미징을 수행하는 동안 어려움을 겪을 수 있습니다.
망막 전체 장착을 위해 조직을 수집하려면 구부러진 가위를 사용하여 안락사 된 C57-Black / 6 강아지의 안와 조직에서 안구를 분리하십시오. 그런 다음 구부러진 집게를 안구의 뒤쪽 부분에 삽입하여 시신경을 고정하고 눈을 궤도에서 빠르게 들어 올립니다. 미리 냉각된 PBS에 안구를 넣어 표면에서 머리카락과 혈액을 제거합니다.
모든 안구가 수집되면 세척 된 안구를 4 % 파라 포름 알데히드가 포함 된 2 밀리리터 미세 원심 분리 튜브로 옮기고 실온에서 15 분 동안 배양하고 분당 12-15 회전합니다. 배양이 끝나면 해부 현미경으로 배양 접시의 중앙에 PBS 한 방울을 넣고 하나의 안구를 방울에 넣습니다. 한 쌍의 집게로 안구를 잡고 1 밀리리터 주사기 바늘을 사용하여 각막 윤부의 각막을 조심스럽게 뚫습니다.
한 쌍의 가위 끝을 구멍에 넣고 망막을 자르지 않도록 조심하면서 각막 윤부를 따라 각막을 자릅니다. 집게를 사용하여 홍채와 렌즈를 제거하고 남은 아이컵을 4%파라포름알데히드에 넣어 셰이커의 실온에서 45분 동안 배양합니다. 배양이 끝나면 고정 된 아이 컵을 새로운 배양 접시의 중앙에있는 신선한 PBS 방울에 놓습니다.
한 쌍의 집게로 아이 컵을 잡고 두 번째 집게를 사용하여 망막과 공막 층을 부드럽게 분리하십시오. 망막과 공막 층 사이에 가위 끝을 놓고 공막을 시신경쪽으로 자릅니다. 망막에서 공막을 벗겨 망막 컵을 얻습니다.
집게를 사용하여 방사형 히알로이드 혈관과 말초 망막 사이의 연결을 해제하십시오. 팁이 잘린 2 밀리리터 피펫을 사용하여 망막 컵을 48 웰 플레이트의 한 웰로 옮기고 셰이커의 실온 PBS에서 5 분 동안 3 회 세척합니다. 마지막 세척 후 컵을 PBS의 1% 트리톤 X-100 및 5% 일반 당나귀 혈청에 섭씨 4도에서 밤새 배양합니다.
망막 혈관 구조에 이소렉틴 B4를 라벨링하려면 셰이커에서 섭씨 4도에서 밤새 아이솔렉틴 B4-594가 보충 된 400 마이크로 리터 0.1 % 일반 당나귀 혈청의 48 웰 플레이트의 한 웰에서 망막을 배양합니다. 필요한 경우 다른 1 차 항체를 동시에 첨가 할 수 있습니다. 다음 날, 셰이커에서 0.1%PBST로 20분 세척 3회로 망막을 세척합니다.
마지막 세척 후, 실온에서 1시간 동안 적절한 고친화성 2차 항체와 함께 망막을 인큐베이션한 후 샘플을 DAPI로 20 내지 25분 동안 라벨링한다. 배양이 끝나면 흔들면서 실온에서 0.1%PBST로 3회 30분 세척하여 망막을 세척합니다. 마지막 세척 후 망막 컵을 개구부가 위를 향하도록 깨끗한 슬라이드로 옮기고 현미경을 사용하여 주변에서 중심을 향해 시신경 머리에서 최대 1-1.5mm까지 3시, 6시, 9시 및 12시 위치에서 방사상으로 망막을 절단합니다.
망막을 세 번 헹구기 전에 세척 당 PBS 몇 방울로 헹구고 공기 종이를 사용하여 망막을 말리고 평평하게합니다. 액적의 직경이 커버슬립의 절반을 덮을 때까지 커버슬립 중앙에 장착 매체를 한 방울 떨어뜨립니다. 그런 다음 커버슬립 장착 매체 면을 아래로 향하게 하여 펼쳐진 망막에 빠르게 놓습니다.
모든 망막 플랫 마운트가 준비되면 컨포칼 형광 현미경으로 샘플을 이미지화할 수 있습니다. 생체 내 영상의 경우 20마이크로리터의 산동 점안액을 추가하여 오래 지속되는 동공 확장을 달성합니다. 5분 후, 이미징 장치 앞의 작은 가열 패드에 새끼를 안정적인 위치에 놓습니다.
각막의 수분을 유지하려면 이미징 절차 전반에 걸쳐 정기적으로 인공 눈물을 추가하십시오. 그런 다음 장치에서 적외선 안저 이미징을 클릭하여 시신경 헤드를 화면 중앙으로 조정합니다. 150 마이크로 리터의 0.5 % 플루오레 세인 나트륨 염 용액을 복강 내 주사하고 즉시 이미징 장치의 터치 패널에있는 FA 및 주입 버튼을 클릭하여 타이머를 시작합니다.
3 분 후, 망막의 혈액 순환이 정맥 단계에 들어가면 중앙 망막의 첫 번째 이미지를 얻습니다. 시신경 헤드가 이미지 획득 영역의 한쪽 중간 지점에 위치할 때까지 이미징 장치의 렌즈를 눈의 비강 쪽으로 수평으로 이동하고 두 번째 이미지를 촬영합니다. 렌즈를 계속 움직이고 같은 방식으로 측두엽, 상급 망막, 하부 망막의 이미지를 획득하십시오.
적절한 이미징 처리 프로그램에서 망막 이미지를 처리하려면 파일 메뉴를 열고 새로 만들기를 클릭하여 검은색 배경의 새 캔버스를 만듭니다. 중앙 망막의 이미지를 엽니 다. 그런 다음 파일을 클릭하여 두 번째 이미지를 추가합니다.
두 번째 이미지의 불투명도를 60%로 조정하고 두 이미지가 겹칠 때까지 이미지를 이동하고 크기를 조정합니다. 자유 변형 모드와 변형 모드 간 전환을 클릭하고 필요한 경우 선박을 미묘하게 조정합니다. 그런 다음 두 번째 이미지의 불투명도를 다시 100%두 이미지 모두 선택하고 [레이어 자동 혼합]을 클릭합니다.
혼합 방법으로 파노라마를 선택하고 매끄러운 색조 및 색상 및 내용 인식 채우기 투명 영역 상자도 선택합니다. 확인을 클릭하여 처음 두 이미지의 스티칭을 완료합니다. 다음으로, 세 번째 이미지를 추가하고 단일 망막에서 5개의 이미지가 모두 스티칭될 때까지 이 이미지를 처음 두 이미지에 스티칭합니다.
분석의 모든 이미지가 처리되면 자르기 도구를 사용하여 FFA 이미지를 균일한 크기로 자릅니다. 고 산소증에 노출 된 지 5 일 후, 출생 후 12 마리의 새끼의 중심 망막은 큰 비 관류 영역을 보여줍니다. 5 일간의 저산소 상태로 옮겨지면 망막은 점차적으로 신생 혈관을 형성하여 주변의 정상 혈관에서 관찰되는 것보다 더 강한 형광 신호의 증가를 나타냅니다.
출생 후 17 일 후, 병리학 적 신생 혈관은 빠르게 퇴행하고 망막은 출생 후 25 일까지 완전히 정상적인 모습을 보입니다. 산소 유발 망막병증 모델의 우수한 반복성 및 안정성은 새끼의 깔짚 크기 및 출생 후 체중 증가를 제어함으로써 달성될 수 있다. 관찰된 바와 같이, 혈관 소멸은 일반적으로 출생 후 12일에 최고조에 달하고 출생 후 25일에 사라지는 반면, 신생혈관은 출생 후 17일에 최고조에 달하고 출생 후 25일까지 퇴행합니다.
출생 후 15 내지 25일째 산소-유도성 망막병증 마우스에서, 망막 혈관 직경은 정상 마우스의 망막에 대해 관찰된 것에 비해 증가하고 매우 고문적이 된다. 왼손의 집게는 주로 지원 역할을합니다. 안구를 변형 시키거나 파열시킬 수있는 안구를 쥐어 짜지 않도록주의하십시오.
