نشكر الأستاذ الدكتور أ. فينوجرادوف وGrivennikova فيرا لإدخال الكتاب في ميدان البيولوجيا الميتوكوندريا ورؤى كثيرة مفيدة والمشورة في هذا الإجراء. المؤلفون ممتنون السيدة أماندا McKintock من مكتب جامعة كوينز وسائل الإعلام للمساعدة في إعداد الفيديو.

مقدمة الميتوكوندريا من قلب فأر واحدة من الأكثر شيوعا في الأعمال التحضيرية للدراسات السابقة والحالية في عملية الأيض الخلوية. ويمكن الحصول عليها بسرعة وبشكل موثوق في كمية كبيرة من نوع البرية أو الحيوانات خروج المغلوب. الإجراء عامة تتألف من الأنسجة التي تجزيء عملية الهضم ، والتربسين الطرد المركزي المغاير. هناك العديد من الشروط التي يجب أن تبقى خلال عزل الميتوكوندريا من الأنسجة المختلفة ، بما في ذلك القلب (الشكل 1). <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نسيج يجب أن يكون المفروم جيدا ، لأنه يؤثر تأثيرا مباشرا على محصول الميتوكوندريا التي حصل عليها. أنسجة القلب من الأفضل أن اللحم المفروم مع مقص منحني الصغيرة ويمكن أن تتبعها استخدام طاحونة Latapie الأنسجة ، أو إذا كان طاحونة الأنسجة غير متوفر ، والصحافة والثوم مع قطر الثقوب مخرج قطرها حوالي 1.0 ملم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> فمن الضروري للحفاظ على درجة حرارة الحلول في كل خطوة. ولذلك الإجراء بأكمله والتي ستنفذ في غرفة باردة وجميع الصكوك والحلول يجب أن تكون مستعدة وتبريده مقدما. إذا كنت لا يمكن أن أبقى ظروف الحرارة تفقد العديد من الخصائص المستقرة للإعداد. هيكل الميتوكوندريا هي حساسة جدا لتجميد overfreezing ذلك لتعليق (على سبيل المثال أثناء الطرد المركزي) غير مسموح به ، لا سيما إذا دراسات النقل النشط والهام. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> معلمة المهم هو الوقت المناسب للطول الداخلي ؛ يجب أن يتم تنفيذ العزل في أسرع وقت ممكن ، والتحضير لابد من الحصول على استخدامها على الفور. ولذلك ، الأدوات الجراحية ، والحلول والأجهزة يجب أن تكون معدة مسبقا. </li></ul> المواد والأدوات الصكوك <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مستقيم مقص التشغيل ، نقطة حادة </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مقص منحني </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ملقط </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> طبق بتري </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قمع صغير + قطعة من النايلون تصفية (prewashed) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 6 أكواب 50 مل </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> النمامون اثنين المغناطيسي والحمامات الجليد two </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حمام واحد كبير الجليد </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 2 أشرطة مغناطيسية صغيرة </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ملاعق للتجريف بيليه </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أنابيب الطرد المركزي </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> (يمكن استبداله مع الصحافة الثوم) Latapie الصحافة الأنسجة </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تفلون الزجاج homogenisers 20ml و 1 - 2ml </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> النفايات الدورق </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إيبندورف أنابيب لتعليق الميتوكوندريا النهائي وعينات لتحديد البروتين </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حمامات الجليد </li></ol> حلول (محسوبة بنسبة 2 الجرذان) : <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل العازلة : 0.3 السكروز M ، HEPES 10 ملم (7.2 درجة الحموضة =) ، و 0.2 ملي EDTA (1000 مل) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> العازلة العزلة : 0.3 السكروز M ، HEPES 10 ملم (الرقم الهيدروجيني = 7.4) ، 0.2 ملي EDTA ، 1 ملغ / مل BSA (سيغما A6003) (100ML أعدت من المخزن المؤقت الغسل). يمكن أن تكون بديلا ألبومين المصل البقري بنسبة أقل تكلفة نظائرها خال من الأحماض الدهنية. ويمكن استخدام نفس المنطقة العازلة أو الاختلافات في متساوي التوتر وإعادة التعليق العازلة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> التربسين (سيغما T8003) الحل : في 2.5mg/ml 1MM حمض الهيدروكلوريك (0.5 مل) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مثبط التربسين من فول الصويا (سيغما T9128) 6.5 مل من mg/10 عازلة عزل </li></ol> بروتوكول ويظهر المخطط العام للالإجراء على الشكل. 1. يجب أن يبرد القلوب وغسلها في غسالة الأنسجة العازلة البطين ، رفعه ، المفروم ومتجانسة أثناء العلاج الضوئي مع التربسين. يتم طرد تعليق على سرعة منخفضة ويتم طرد وطاف حصلت مرة أخرى في أعلى سرعة لجمع الميتوكوندريا. يمكن بالاعتماد على التجارب المقررة الاستعاضة عن إعادة التعليق العازلة التي متساوي التوتر أي حل آخر. أنهيت الحيوانات وفقا للالمملكة المتحدة &quot;حيوانات (الإجراءات العلمية) القانون&quot;. عنق الرحم عن طريق الخلع تلتها قطع الرأس. فمن الضروري لاستخراج القلب مباشرة بعد قطع الرأس للحيوان ، حتى لا يكون هناك أي تأخير إنهاء بين الحيوانات واستخراج القلب. إذا كان من المتوقع أن العزلة موازية للكبد الميتوكوندريا يكون صام الفئران ليلا قبل التجربة. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد ثلاثة أكواب تحتوي على 40 مل من الغسل العازلة. تبريدها في حمام الثلج الملح لمدة 3 إلى 5 دقائق قبل الانتقال الى الخطوة التالية. تأكد من عدم overfreeze لهم واستخدامها على الفور بعد السحب من بلورات الثلج تبدأ في الظهور. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> فتح القفص الصدري للفأر مقطوعة الرأس واستخراج القلب. جعل شقوق صغيرة ثم نقل على الفور إلى حل وسط الجليد الباردة في الدورق الأول. تضغط على القلب لإزالة الدم ووضعها في الدورق الثاني. كرر هذه العملية لكل القلب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قلوب جافة على ورقة الترشيح. إزالة كل الدهون والدم متخدر ، أذينات فافة وحمام سباحة والنسيج البطين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> فرم النسيج المجمعة مع مقص منحني صغيرة على طبق بيتري على الجليد لحوالي 5 دقائق حتى حجم الجسيمات حوالي 1-2 ملم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع الأنسجة المفروم في الصحافة الأنسجة وتمريرمن خلال. أن تدرك أن كمية كبيرة من المواد يمكن أن تبقى في الصحافة حتى جمع جميع أنسجة القلب من أسفل الجدران والصحافة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل المواد الى الدورق مع 50 مل الاحتياطي الغسل ويحرك. ثم تصفية تعليق من خلال مرشح النايلون. يغسل النسيج مفروم على 3 مرات مع مرشح الاحتياطي الغسل ورفض الترشيح. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل الأنسجة غسلها في 20 مل من الاحتياطي الغسيل ووضعه في حمام الثلج على مغناطيسي. إضافة 0.5 مل من محلول التربسين مع التحريك المستمر وبدء موقت. إعداد آخر مغناطيسي ، حمام الثلج والثاني 50 مل دورق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في الدقيقة ال 4 homogenise فترة وجيزة على جزء التعليق من استخدام جزء صغير مجهز بشكل فضفاض الزجاج تفلون homogeniser (10 - 15ml) مع بعدة جلطات صعودا وهبوطا لتفريق بسبب الايقاف. بعد تعليق نقل تجانس في الدورق الثاني. كرر الإجراء في الدقيقة ال 9 ، بحيث يمكنك تنفيذ تجانس لوقف مرتين في المجموع. بعد 15 دقيقة من الحضانة ، إضافة 10 مل من عزل مثبط التربسين العازلة التي تحتوي على واحتضان لمدة 1 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تصفية التعليق مرة أخرى من خلال مرشح النايلون وحفظ الترشيح. جمع الكسر الجسيمات اليسار على مرشح وhomogenise لمدة 1 دقيقة في 15-20 مل من الاحتياطي الغسل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الجمع بين جناسة مع الترشيح والطرد المركزي لمدة 15 دقيقة في 600G. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تصفية بعناية طاف الناتج إلى أنبوب الطرد المركزي الجديدة. تجنب التلوث من قبل بيليه وأجهزة الطرد المركزي مرة أخرى لمدة 15 دقيقة في 8500g. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد الطرد المركزي بسرعة عالية وتجاهل طاف شطف 2-3 مرات بيليه مع 1 مل من تجاهل للرقيق الأبيض العازلة طبقة الحافة الخارجية. تفريق بيليه مع ملعقة ولكن تجنب بقعة حمراء من الكريات الحمراء في الأسفل. إذا حصلت على لوس خلايا الدم ، وإزالة البتات الحمراء من التعليق قبل التجانس. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend الكرية مع homogeniser صغيرة أو بالتناوب pipetting لطيف. تمييع التعليق مع أكثر Isolationbuffer وأجهزة الطرد المركزي مرة أخرى لمدة 15 دقيقة في 8500g. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تجاهل طاف ، resuspend الكرية في إعادة التعليق عازلة (وجود مخزن مؤقت متساوي التوتر في الاختيار) ، وأجهزة الطرد المركزي مرة أخرى. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الناتج البني بيليه يحتوي الميتوكوندريا سليمة غسلها. Resuspend الكرية في حجم صغير جدا من المخزن متساوي التوتر التي تختارها. </li></ol><img src="/files/ftp_upload/2202/2202fig1.jpg" alt="الشكل 1" /> الشكل 1. مخطط يدل على خطوة خطوة من إجراءات العزل من قلب فأر الميتوكوندريا. الجزء العلوي ، 1-9 مراحل : تعطيل الأنسجة والعلاج التربسين وتجانس ؛ الجزء السفلي ، ومراحل 10-15 : الطرد المركزي المغاير.

<ol>
	<li>Jacobus, W. E., Saks, V. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Creatine+kinase+of+heart+mitochondria:+changes+in+its+kinetic+properties+induced+by+coupling+to+oxidative+phosphorylation.">Creatine kinase of heart mitochondria: changes in its kinetic properties induced by coupling to oxidative phosphorylation.</a> Arch. Biochem. Biophys. 219, 167-178 (1982).</li><li>Gostimskaya, I. S., Grivennikova, V. G., Zharova, T. V., Bakeeva, L. E., Vinogradov, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+assay+of+the+intramitochondrial+enzymes:+use+of+alamethicin+for+permeabilization+of+mitochondria.">In situ assay of the intramitochondrial enzymes: use of alamethicin for permeabilization of mitochondria.</a> Anal. Biochem. 313, 46-52 (2003).</li></ol>

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

يوصف بروتوكول السريع مفصلة لعزل الميتوكوندريا سليمة مع وجود درجة عالية من اقتران. ويمكن استخدام إعداد البحوث الفنية التي تم الحصول عليها لأو الهيكلي على الطاقة الحيوية الخلوية ، والدراسات البروتين أو تحليل الحمض النووي والمحتوى الدهني. ويمكن أيضا للدراسات البيوفيزيائية النقل النشط للأيونات وسيطة الأيضية أن يؤديها. فمن الممكن لعملية إعداد مزيد من الميتوكوندريا من أجل عزل جزيئات submitochondrial ، الغشاء الخارجي أو مكونات منفصلة تنقية الفسفرة المؤكسدة. وصف الأسلوب هو تعديل للبروتوكول قياسي من العزلة التي وجاكوبوس ساكس 1. العائد المتوقع من الميتوكوندريا أعد ما يقرب من 10-15 ملغ من البروتين الميتوكوندريا في القلب والجهاز التنفسي نسبة السيطرة على مالات / الغلوتامات إعداد مثل هذه تختلف ما بين 8 إلى 12 مع تنفس رابعا الدولة نحو 0.12 μmol O البروتين xmin xmg 2 -1 -1 عند 23 درجة مئوية في المتوسط ​​تضم السكروز 0.25 م و 10 ملي بوكل ، EDTA 0.2 ملم ، 5 فوسفات البوتاسيوم ملم (8.0 درجة الحموضة) مع ADP 150 ميكرومتر لبدء التنفس ثالثا الدولة (للظروف الدقيقة والإضافات التجريبية ، انظر المرجع 2). وينبغي إيلاء اهتمام خاص لالتفاصيل التقنية قبل عدة بدءا من إجراءات العزل. فمن الأهمية بمكان أن الاستخدام النظيف البولي بروبلين أو أنابيب الطرد المركزي ، وبالتالي ينبغي أنابيب غسلها جيدا بفرشاة نظيفة والماء الساخن ، ولكن ينبغي أن تظل معاملة المنظفات في الحد الأدنى. أيضا ، فمن الأفضل لجمع كل الأواني والأدوات اللازمة في الغرفة الباردة قبل يوم من العزلة. خلال العزلة عندما نقل إلى مخازن قوارير من الأكواب ، ينبغي إيلاء اهتمام خاص а لمنع قطرات من الماء المثلج في الحلول. يجب عند التعامل مع الأنسجة ينبغي التشديد على أنه ينبغي أن يتم استخراج القلب في أقرب وقت ممكن حتى منذ فترة قصيرة من التأخير بين انفصال رأس الحيوان وتبريد الأنسجة من شأنه أن يؤدي في الميتوكوندريا uncoupled جزئيا. التبريد السريع والغسل الكامل للقلوب إزالة أمر ضروري للحصول على إعداد المعيار ، وخالية من خضاب الدم وكرات الدم الحمراء NADase. يستخدم التربسين عن تدهور البروتينات الضام لزيادة حساسية الأنسجة للقوة القص خلال التجانس. وينبغي تجنب التعرض لفترة طويلة من النسيج البروتيني لأنها نتيجة في الميتوكوندريا من نوعية رديئة. وينبغي بعد centrifugations عالية السرعة أن تمحى من على الجدران أنابيب الطرد المركزي مع المناديل الورقية لإزالة أي رواسب من المواد الدهون المتراكمة على الجدران. لإعادة تعليق النهائي فإنه من الأفضل استخدام حجم منخفض من المنطقة العازلة النهائية من أجل تقليل الخسائر في الوظائف الميتوكوندريا أثناء التخزين (150 الى 200 ميكرولتر من المنطقة العازلة في القلب). لإجراء دراسات حول نقل الكاتيونات ثنائي التكافؤ يجب أن أية عوامل مخلبية تكون موجودة في الميتوكوندريا الإعداد النهائي وبالتالي يجب غسلها عدة مرات مع EGTA خالية المتوسطة واستخدامها في غضون ساعات الأولى بعد العزلة.

preparation of highly coupled rat heart mitochondria

ومن المعترف به على نطاق واسع وظيفة الميتوكوندريا في توليد ATP الخلوية في عملية الفسفرة المؤكسدة. خلال العقود الماضية لم يكن هناك تقدم كبير في فهمنا لوظائف أخرى من الميتوكوندريا توليد الطاقة. وتشمل هذه دورها في موت الخلايا المبرمج ، بوصفها إشارات العضيات ، والتنمية في الثدييات والشيخوخة ، فضلا عن مساهمتها في التنسيق بين الخلايا والأيض تكاثر الخلايا. ويستند فهمنا من العمليات البيولوجية عن طريق التضمين الميتوكوندريا على أساليب العزل وقوية لمعالجة سليمة الميتوكوندريا من الأنسجة من الحيوانات المختبرية. الميتوكوندريا من قلب فأر واحدة من الأكثر شيوعا في الأعمال التحضيرية للدراسات السابقة والحالية في عملية الأيض الخلوية بما في ذلك دراسات على الحيوانات ، بالضربة القاضية. نحن هنا وصف مفصل الأسلوب السريع لعزل الميتوكوندريا سليمة مع وجود درجة عالية من اقتران. هذا النوع من التحضير لقلب فأر الميتوكوندريا هو كائن ممتازة للبحوث الفنية والهيكلية على الطاقة الحيوية الخلوية ، ونقل الجزيئات الحيوية ، ودراسات وتحليل البروتين الحمض النووي والبروتينات والدهون.

Watch this Scientific Journal Video about Preparation of Highly Coupled Rat Heart Mitochondria at JoVE.com

Preparation of Highly Coupled Rat Heart Mitochondria

وصفنا а بروتوكول للعزلة من الذهب الخالص ، والقلب الفئران المقرون بدرجة عالية الميتوكوندريا للدراسات وظيفية أو هيكلي من الطاقة الحيوية الخلوية ، والقياسات البيولوجية والفيزيائية ، البروتيوميات أو الحمض النووي وتحليل الدهون.

إعداد قلب فأر اقترن الارتحال الميتوكوندريا

The function of mitochondria in generation of cellular ATP in the process of oxidative phosphorylation is widely recognised. During the past decades there ...

preparation-of-highly-coupled-rat-heart-mitochondria

Research

JoVE Journal

Biology

22.7K Views.  University of Manchester. وصفنا а بروتوكول للعزلة من الذهب الخالص ، والقلب الفئران المقرون بدرجة عالية الميتوكوندريا للدراسات وظيفية أو هيكلي من الطاقة الحيوية الخلوية ، والقياسات البيولوجية والفيزيائية ، البروتيوميات أو الحمض النووي وتحليل الدهون.

Video: Preparation of Highly Coupled Rat Heart Mitochondria

Implantation of Engineered Tissue in the Rat Heart

Rodent surgery is often an important component in assessing the utility of engineered tissues. A wide variety of surgical procedures can be performed in common laboratory rats or mice and these quite frequently serve as an intermediate step between bench-top experiments and large animal testing or human trials. Given that rodents provide an established, cost-effective, and physiologically-relevant model system in which to test novel combinations of scaffolding materials and cells, they are particularly well-suited for cardiovascular tissue engineering studies. Presently, we describe an open-heart surgical procedure to implant engineered tissue containing myogenic progenitor cells in the atrioventricular (AV) groove of a rat heart. These implants are intended to create an electrical conduit between the right atrium and right ventricle with the ultimate goal of providing an alternative treatment to conventional pacemaker implantation in pediatric patients with complete heart block[1]. The engineered tissue is implanted in the AV-groove by means of a thoracotomy. For our purposes, Lewis rats are anesthetized and invasively ventilated to maintain positive airway pressure during the sterile surgical procedure. The approach to the heart is performed by a right thoracotomy through an antero-lateral incision at the 5th intercostal space. The tissue construct is fixed in the AV groove using a single 7-0 Prolene suture and positioned between the right ventricle and atrium at the ventral portion of the heart. The epicardium is partially removed to allow direct contact between the recipient myocardial cells and those contained in the engineered tissue. Following implantation, the chest wall is closed in layers, any pneumothorax is evacuated, and the animal is extubated and treated with analgesic.

Here, we describe a cardiac surgical procedure to implant engineered tissue in the atrioventricular (AV)-groove of an adult Lewis rat.

زرع الأنسجة المهندسة في قلب فأر

Rodent surgery is often an important component in assessing the utility of engineered tissues. A wide variety of surgical procedures can be performed in ...

Primary Culture of Adult Rat Heart Myocytes

Cultured primary adult rodent heart cells are an important model system for cardiovascular research. Nevertheless, establishment of robust, viable cultured adult myocytes can be a technically challenging, rate-limiting step for many researchers. Here we described a protocol to obtain a high yield of adult rat heart myocytes that remain viable in culture for several days. The heart is isolated and perfused with collagenase and protease under low Ca2+ conditions to recover single myocytes. Ca2+-tolerant cells are obtained by stepwise increases in extracellular Ca2+ concentration in three subsequent wash steps. Cells are filtered, resuspended in culture medium, and plated on laminin coated slips. Cultured myocytes obtained using this protocol are viable for up to four days and are suitable for most experiments including electrophysiology, biochemistry, imaging and molecular biology.

In this paper, we described a typical way to isolate and culture adult rat heart myocytes. Collagenase and protease are used to digest and isolate single myocytes. Myocytes cultured follow this protocol meet most experiment requirements.

الابتدائية ثقافة الكبار Myocytes قلب فأر

Cultured primary adult rodent heart cells are an important model system for cardiovascular research.  Nevertheless, establishment of robust, viable ...

Purification of Mitochondria from Yeast Cells

Mitochondria are the main site of ATP production during aerobic metabolism in eukaryotic non-photosynthetic cells1. These complex organelles also play essential roles in apoptotic cell death2, cell survival3, mammalian development4, neuronal development and function4, intracellular signalling5, and longevity regulation6. Our understanding of these complex biological processes controlled by mitochondria relies on robust methods for assessing their morphology, their protein and lipid composition, the integrity of their DNA, and their numerous vital functions. The budding yeast Saccharomyces cerevisiae, a genetically and biochemically manipulable unicellular eukaryote with annotated genome and well-defined proteome, is a valuable model for studying the molecular and cellular mechanisms underlying essential biological functions of mitochondria. For these types of studies, it is crucial to have highly pure mitochondria. Here we present a detailed description of a rapid and effective method for purification of yeast mitochondria. This method enables the isolation of highly pure mitochondria that are essentially free of contamination by other organelles and retain their structural and functional integrity after their purification. Mitochondria purified by this method are suitable for cell-free reconstitution of essential mitochondrial processes and can be used for the analysis of mitochondrial structure and functions, mitochondrial proteome and lipidome, and mitochondrial DNA.

We describe a rapid and effective method for purification of mitochondria from the yeast Saccharomyces cerevisiae. This method enables the high-yield isolation of pure mitochondria that are essentially free of contamination by other organelles and retain their structural and functional integrity after their purification.

تنقية الميتوكوندريا من خلايا الخميرة

Mitochondria are the main site of ATP production during aerobic metabolism in eukaryotic non-photosynthetic cells1. These complex organelles also play ...

Preparation of embryos for Electron Microscopy of the Drosophila embryonic heart tube

The morphogenesis of the Drosophila embryonic heart tube has emerged as a valuable model system for studying cell migration, cell-cell adhesion and cell shape changes during embryonic development. One of the challenges faced in studying this structure is that the lumen of the heart tube, as well as the membrane features that are crucial to heart tube formation, are difficult to visualize in whole mount embryos, due to the small size of the heart tube and intra-lumenal space relative to the embryo. The use of transmission electron microscopy allows for higher magnification of these structures and gives the advantage of examining the embryos in cross section, which easily reveals the size and shape of the lumen. In this video, we detail the process for reliable fixation, embedding, and sectioning of late stage Drosophila embryos in order to visualize the heart tube lumen as well as important cellular structures including cell-cell junctions and the basement membrane.

Preparation of embryos for Electron Microscopy of the Drosophila embryonic heart tube

We describe a process for fixation, embedding, sectioning, and imaging of late stage Drosophila embryos for Trasmission Electron Microscopy of the embryonic heart tube. This technique allows for the visualization of the heart tube lumen as well as the basement membrane, which lines the lumen of the heart.

إعداد الأجنة المجهري للإلكترون من ذبابة الفاكهة أنبوب القلب الجنينية

The morphogenesis of the Drosophila  embryonic heart tube has emerged as a valuable model system for studying cell migration, cell-cell adhesion and cell ...

Preparation of Rat Tail Tendons for Biomechanical and Mechanobiological Studies

Rat tail tendons (RTTs) are a common biological model used in experimental in vitro studies in the fields of tendon physiology and tendinopathy. Working with those tissues is challenging because they are very fragile, and until now there was no rigorously detailed protocol for their isolation.
Faced with these challenges, we have developed methods and instruments to facilitate manipulation of RTTs and control tissue viability, sterility and integrity. This article describes the experimental procedures used to prepare RTTs for biomechanical and mechanobiological studies. Our work is divided into four main steps: extraction, cross-sectional area measurement, rinsing and loading into the bioreactor chamber.
At each step, all procedures, materials and manipulations are presented in detail so that they can be easily reproduced. Moreover, the specific instruments developed are presented: a manipulation plate used to segregate RTTs, an optic micrometer to position the tissue during the cross-sectional area measurement and an anchoring system to attach the RTTs onto a bioreactor.
Finally, we describe the results obtained after multiple tests to validate our methods. The viability, sterility and integrity evaluations demonstrate that our procedures are sufficiently rigorous for manipulations of fragile tissues such as rat tail tendons.

This article describes the experimental procedures used to prepare rat tail tendons for biomechanical and mechanobiological studies. Several features of the main steps in preparation are demonstrated, beginning with extraction, cross-sectional area measurement, rinsing and loading into the bioreactor chamber.

إعداد الأوتار ذيل فأر النشاط الحيوي للدراسات وMechanobiological

Rat tail tendons (RTTs) are a common biological model used in experimental in vitro studies in the fields of tendon physiology and tendinopathy. Working ...

Multi-parameter Measurement of the Permeability Transition Pore Opening in Isolated Mouse Heart Mitochondria

The mitochondrial permeability transition pore (mtPTP) is a non specific channel that forms in the inner mitochondrial membrane to transport solutes with a molecular mass smaller than 1.5 kDa. Although the definitive molecular identity of the pore is still under debate, proteins such as cyclophilin D, VDAC and ANT contribute to mtPTP formation. While the involvement of mtPTP opening in cell death is well established1, accumulating evidence indicates that the mtPTP serves a physiologic role during mitochondrial Ca2+ homeostasis2, bioenergetics and redox signaling 3.
mtPTP opening is triggered by matrix Ca2+ but its activity can be modulated by several other factors such as oxidative stress, adenine nucleotide depletion, high concentrations of Pi, mitochondrial membrane depolarization or uncoupling, and long chain fatty acids4. In vitro, mtPTP opening can be achieved by increasing Ca2+ concentration inside the mitochondrial matrix through exogenous additions of Ca2+ (calcium retention capacity). When Ca2+ levels inside mitochondria reach a certain threshold, the mtPTP opens and facilitates Ca2+ release, dissipation of the proton motive force, membrane potential collapse and an increase in mitochondrial matrix volume (swelling) that ultimately leads to the rupture of the outer mitochondrial membrane and irreversible loss of organelle function.
Here we describe a fluorometric assay that allows for a comprehensive characterization of mtPTP opening in isolated mouse heart mitochondria. The assay involves the simultaneous measurement of 3 mitochondrial parameters that are altered when mtPTP opening occurs: mitochondrial Ca2+ handling (uptake and release, as measured by Ca2+ concentration in the assay medium), mitochondrial membrane potential, and mitochondrial volume. The dyes employed for Ca2+ measurement in the assay medium and mitochondrial membrane potential are Fura FF, a membrane impermeant, ratiometric indicator which undergoes a shift in the excitation wavelength in the presence of Ca2+, and JC-1, a cationic, ratiometric indicator which forms green monomers or red aggregates at low and high membrane potential, respectively. Changes in mitochondrial volume are measured by recording light scattering by the mitochondrial suspension. Since high-quality, functional mitochondria are required for the mtPTP opening assay, we also describe the steps necessary to obtain intact, highly coupled and functional isolated heart mitochondria.

A spectrofluorometric protocol for the measurement of the mitochondrial permeability transition pore opening in isolated mouse heart mitochondria is presented here. The assay involves the simultaneous measurement of mitochondria Ca2+ handling, mitochondrial membrane potential and mitochondrial volume. The procedure for obtaining high-quality and functional heart mitochondria is also described.

متعدد المعلمة قياس نفاذية المسام افتتاح المرحلة الانتقالية في القلب ماوس متفرقة الميتوكوندريا

The mitochondrial permeability transition pore (mtPTP) is a non specific channel that forms in the inner mitochondrial membrane to transport solutes with ...

Confocal Imaging of Single Mitochondrial Superoxide Flashes in Intact Heart or In Vivo

Mitochondrion is a critical intracellular organelle responsible for energy production and intracellular signaling in eukaryotic systems. Mitochondrial dysfunction often accompanies and contributes to human disease. Majority of the approaches that have been developed to evaluate mitochondrial function and dysfunction are based on in vitro or ex vivo measurements. Results from these experiments have limited ability in determining mitochondrial function in vivo. Here, we describe a novel approach that utilizes confocal scanning microscopy for the imaging of intact tissues in live aminals, which allows the evaluation of single mitochondrial function in a real-time manner in vivo. First, we generate transgenic mice expressing the mitochondrial targeted superoxide indicator, circularly permuted yellow fluorescent protein (mt-cpYFP). Anesthetized mt-cpYFP mouse is fixed on a custom-made stage adaptor and time-lapse images are taken from the exposed skeletal muscles of the hindlimb. The mouse is subsequently sacrificed and the heart is set up for Langendorff perfusion with physiological solutions at 37 &deg;C. The perfused heart is positioned in a special chamber on the confocal microscope stage and gentle pressure is applied to immobilize the heart and suppress heart beat induced motion artifact. Superoxide flashes are detected by real-time 2D confocal imaging at a frequency of one frame per second. The perfusion solution can be modified to contain different respiration substrates or other fluorescent indicators. The perfusion can also be adjusted to produce disease models such as ischemia and reperfusion. This technique is a unique approach for determining the function of single mitochondrion in intact tissues and in vivo.

Confocal Imaging of Single Mitochondrial Superoxide Flashes in Intact Heart or In Vivo

Confocal scanning microscopy is applied for imaging single mitochondrial events in perfused heart or skeletal muscles in live animal. Real-time monitoring of single mitochondrial processes such as superoxide flashes and membrane potential fluctuations enables the evaluation of mitochondrial function in a physiologically relevant context and during pathological perturbations.

التصوير متحد البؤر واحدة من الميتوكوندريا الأكسيد ومضات في القلب سليمة أو<em&gt; في فيفو</em

Mitochondrion is a critical intracellular organelle responsible for energy production and intracellular signaling in eukaryotic systems. Mitochondrial ...

Preparation of Rat Serum Suitable for Mammalian Whole Embryo Culture

Mammalian whole embryo culture (WEC) is a widely used technique for examining pharmacological toxicity in developing mouse and rat embryos and for investigating the mechanisms of developmental processes. Immediately centrifuged (IC) rat serum is commonly used for WEC and is essential for the growth and development of cultured mouse and rat embryos ex vivo. For the culture of midgestation embryos (i.e., E8.0-12.5 for the mouse, and E10.0-14.5 for the rat), 100% rat serum is the best media for supporting the growth of the embryo ex vivo. To prepare rat serum suitable for WEC, the collected blood should be centrifuged immediately to separate the blood cells from the plasma fraction. After centrifugation, the fibrin clot forms in the upper layer; this clot should be squeezed gently using a pair of sterile forceps and subsequently centrifuged to completely separate the blood cells from the serum. In this video article, we demonstrate our standard protocol for the preparation of optimal IC rat serum, including blood collection from the abdominal aorta of male rats and extraction of the serum by centrifugation.

Mammalian whole embryo culture (WEC) is widely used in teratology and developmental biology. Immediately centrifuged rat serum is commonly provided as a medium for both mouse and rat WEC. In this video, we demonstrate our standard protocol for the preparation of high-quality rat serum suitable for mammalian WEC.

إعداد الجرذ مصل مناسب للالثدييات الجامع الثقافة الأجنة

Mammalian whole embryo culture (WEC) is a widely used technique for examining pharmacological toxicity in developing mouse and rat embryos and for ...

Automated Modular High Throughput Exopolysaccharide Screening Platform Coupled with Highly Sensitive Carbohydrate Fingerprint Analysis

Many microorganisms are capable of producing and secreting exopolysaccharides (EPS), which have important implications in medical fields, food applications or in the replacement of petro-based chemicals. We describe an analytical platform to be automated on a liquid handling system that allows the fast and reliable analysis of the type and the amount of EPS produced by microorganisms. It enables the user to identify novel natural microbial exopolysaccharide producers and to analyze the carbohydrate fingerprint of the corresponding polymers within one day in high-throughput (HT). Using this platform, strain collections as well as libraries of strain variants that might be obtained in engineering approaches can be screened. The platform has a modular setup, which allows a separation of the protocol into two major parts. First, there is an automated screening system, which combines different polysaccharide detection modules: a semi-quantitative analysis of viscosity formation via a centrifugation step, an analysis of polymer formation via alcohol precipitation and the determination of the total carbohydrate content via a phenol-sulfuric-acid transformation. Here, it is possible to screen up to 384 strains per run. The second part provides a detailed monosaccharide analysis for all the selected EPS producers identified in the first part by combining two essential modules: the analysis of the complete monomer composition via ultra-high performance liquid chromatography coupled with ultra violet and electrospray ionization ion trap detection (UHPLC-UV-ESI-MS) and the determination of pyruvate as a polymer substituent (presence of pyruvate ketal) via enzymatic oxidation that is coupled to a color formation. All the analytical modules of this screening platform can be combined in different ways and adjusted to individual requirements. Additionally, they can all be handled manually or performed with a liquid handling system. Thereby, the screening platform enables a huge flexibility in order to identify various EPS.

We present an automated modular high-throughput-method for the identification and characterization of microbial exopolysaccharides in small scale. This method combines a fast preselection to analyze the total amount of secreted polysaccharides with a detailed carbohydrate fingerprint to enable the fast screening of newly isolated bacterial strains or entire strain collections.

الآلي وحدات إنتاجية عالية Exopolysaccharide فحص منصة مقرونا حساسة للغاية تحليل الكربوهيدرات بصمات الأصابع

Many microorganisms are capable of producing and secreting exopolysaccharides (EPS), which have important implications in medical fields, food ...

Methods for the Determination of Rates of Glucose and Fatty Acid Oxidation in the Isolated Working Rat Heart

The mammalian heart is a major consumer of ATP and requires a constant supply of energy substrates for contraction. Not surprisingly, alterations of myocardial metabolism have been linked to the development of contractile dysfunction and heart failure. Therefore, unraveling the link between metabolism and contraction should shed light on some of the mechanisms governing cardiac adaptation or maladaptation in disease states. The isolated working rat heart preparation can be used to follow, simultaneously and in real time, cardiac contractile function and flux of energy providing substrates into oxidative metabolic pathways. The present protocol aims to provide a detailed description of the methods used in the preparation and utilization of buffers for the quantitative measurement of the rates of oxidation for glucose and fatty acids, the main energy providing substrates of the heart. The methods used for sample analysis and data interpretation are also discussed. In brief, the technique is based on the supply of 14C- radiolabeled glucose and a 3H- radiolabeled long-chain fatty acid to an ex vivo beating heart via normothermic crystalloid perfusion. 14CO2 and 3H2O, end byproducts of the enzymatic reactions involved in the utilization of these energy providing substrates, are then quantitatively recovered from the coronary effluent. With knowledge of the specific activity of the radiolabeled substrates used, it is then possible to individually quantitate the flux of glucose and fatty acid in the oxidation pathways. Contractile function of the isolated heart can be determined in parallel with the appropriate recording equipment and directly correlated to metabolic flux values. The technique is extremely useful to study the metabolism/contraction relationship in response to various stress conditions such as alterations in pre and after load and ischemia, a drug or a circulating factor, or following the alteration in the expression of a gene product.

The following protocol describes the preparation and utilization of buffers for the quantitative measurement of rates of glucose and fatty acid oxidation in the isolated working rat heart. The methods used for sample analysis and data interpretation are also discussed.

طرق تقدير من معدلات الجلوكوز والأحماض الدهنية الأكسدة في عزل قلب الجرذ العمل

The mammalian heart is a major consumer of ATP and requires a constant supply of energy substrates for contraction. Not surprisingly, alterations of ...