عزل المجموعات السكانية الرئيسية Megakaryocyte السلف، يسمح للتحليل الدقيق للتسلسل الهرمي النسب في ثقافة الخلية على المقايسات الجزيئية، حتى مستوى الخلية الواحدة. يجمع هذا البروتوكول بين ممارسة أكثر أخلاقية من خلال تقليل عدد الحيوانات المطلوبة ، في عملية فعالة لفرز الخلايا من مجموعات MEP و MKP. للعظم، وجمع رذاذ الجسم من ثمانية إلى 12 أسبوعا C57 الأسود ستة الماوس، مع 70٪الإيثانول.
استخدام مقص لجعل نقطة 5-1 سنتيمتر شق الجلد، عمودي على العمود الفقري. وتمزيق الجلد حول الجسم كله، عن طريق سحبه إلى أسفل. ضع وجه الفأرة لأسفل على لوحة التشريح ، ثم حدد عظام الحوض عن طريق انزلاق الأصابع أو المقص ، على طول العمود الفقري المكشوف ، من أعلى إلى أسفل.
لتحديد موقع قمة الحرقفي، حدد عثرة صغيرة في المنطقة القطنية بالقرب من الأطراف الخلفية. بعد وضع مقص موازية للعمود الفقري، ضد الفقرات، وعلى مقربة من عثرة قمة الحرقفي، والمضي قدما في قطع العضلات على طول الجانب من العمود الفقري فوق عظم الحوض، عن طريق انزلاق مقص على طول الفقرات، وصولا الى الذيل. ثم قطع بين الفقرات وقمة الحرقفي، والبقاء على مقربة من الفقرات قدر الإمكان.
وقطع العضلات المتبقية لفصل الطرف من الجسم. نقل الأطراف المنفصلة إلى سطح نظيف. بعد التخلص من بقية الجسم وفقا للمبادئ التوجيهية المؤسسية، استخدم ملقط ومشرط لفضح عظام الحوض والفخذ والظنبوب، عن طريق إزالة الأنسجة المحيطة بها.
استخدم ملقطا للاحتفاظ بالطرف القاصي من عظم الفخذ ، وخلع رأس الفخذ بعناية من عظم الحوض ، عن طريق تقطيع العضلات بلطف حول المفصل بمشرط. كشط قبالة العضلات المتبقية من عظم الحوض، وقطع في منتصف التجويف الذي عقد رأس الفخذ. الحفاظ على الهيليوم والتخلص من الجانب رقيقة الثلاثي من العظام.
باستخدام مشرط، وإزالة الأنسجة المتبقية حول الهيليوم، ووضع العظام تنظيفها في برنامج تلفزيوني عقيم تكملها 2٪ مصل العجل حديثي الولادة. ثم استخدم مقص لقطع القدم من الساق في الكاحل. عقد الجزء السفلي من الساق مع ملقط، كشط العضلات حتى نحو الركبة.
تجاهل الشظية. ثم جعل قطع عبر الهضبة الظنبوبية مع مشرط، ووضع الساق في برنامج تلفزيوني عقيم 2٪NBCS. بعد إزالة الأنسجة المتبقية حول عظم الفخذ، عقد الجانب العلوي من عظم الفخذ مع ملقط، ووضع شفرة مشرط في قاعدة الرضفة.
تطبيق قوة نحو الرضفة، بالتوازي مع عظم الفخذ لفصل الرضفة. ثم ضع عظم الفخذ، في برنامج تلفزيوني عقيم 2٪NBCS. في خزانة تدفق صفح، نقل العظام إلى طبق بيتري عقيمة مليئة برنامج تلفزيوني عقيم 2٪NBCS.
استخدام مشرط لقطع رأس عظم الفخذ. ملء حقنة ملليلتر واحد مع برنامج تلفزيوني معقم 2٪ NBCS، وإرفاق إبرة قياس 21، إلى منفذ. ثم ملء أنبوب البولي بروبلين خمسة ملليلتر مع اثنين من ملليلتر من برنامج تلفزيوني عقيم 2٪ NBCS.
عقد عظم الفخذ مع ملقط، إدراج الإبرة في الأخدود اليسار، بعد إزالة الرضفة عن طريق تطبيق التناوب، وضمان أن يتم إدراج الإبرة تماما في العظام، حتى شطبة. بعد إدخال الإبرة، نقل العظام مع الإبرة في أنبوب يحتوي على اثنين من ملليلتر من برنامج تلفزيوني 2٪NBCS. ثم الاستغناء عن وتوبيخ برنامج تلفزيوني 2٪ NBCS، من الحقنة حتى العظام واضحة.
إزالة الإبرة من عظم الفخذ، وإدراجه في حفرة في الجانب الآخر، حيث كان رأس عظم الفخذ. بعد الاستغناء عن المخزن المؤقت وقرصنة، تجاهل العظام. لقمة الحرقفي والساق، استخدم ملقط لعقد العظام وإدراج الإبرة بلطف في الجانب المفتوح، عن طريق تطبيق التناوب.
ضمان إدخال الإبرة بالكامل في العظم، حتى الشارف. ثم نقل العظام مع الإبرة في أنبوب يحتوي على اثنين من ملليلتر من برنامج تلفزيوني 2٪ NBCS. الاستغناء عن وتوبيخ برنامج تلفزيوني 2٪ NBCS من الحقنة حتى العظام واضحة.
تمرير كل تعليق الخلية من خلال غطاء 40 ميكرون مصفاة الخلية, وضعت على أنبوب البوليسترين خمسة ملليلتر عقيمة, وإضافة 500 ميكرولتر من PBS 2٪ NBCS. خصص 100 ميكرولتر من تعليق الخلية كنخاع عظمي كامل. ثم تخزينه على الجليد لإجراء تلطيخ.
بيليه تعليق تصفيتها عن طريق الطرد المركزي. بعد التخلص من الناموست، أعيد إنفاق بيليه في كوكتيل الأجسام المضادة الأولية الطازجة، مع الحضانة على الجليد، لمدة 30 إلى 45 دقيقة. جانبا 10 ميكرولتر من تعليق الخلية في أنبوب البوليسترين خمسة ملليلتر معقمة، وصفت لين المسام كسر، وإضافة 90 ميكرولتر من PBS 2٪NBCS.
وفي الوقت نفسه، وإعداد الخرز للنضوب المغناطيسي، عن طريق إعادة تعليق لهم في القارورة، مع دوامة شاملة لمدة 30 ثانية. نقل حجم من الخرز المقابلة لاثنين من الخرز لكل خلية الهدف، في أنبوب البولي بروبلين خمسة ملليلتر، وغسل الخرز مرتين، مع برنامج تلفزيوني 2٪NBCS، عن طريق وضع أنبوب على المغناطيس. بعد إزالة العازلة الغسيل مع ماصة المبستر الزجاج العقيم، resuspend الخرز في 500 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني عقيم 2٪ NBCS.
للخطوة الأولى من الاستنفاد المغناطيسي، إضافة 250 ميكرولتر من الخرز على بيليه من الخلايا المغسولة، واحتضان مع خلط لطيف لمدة خمس دقائق على الجليد. ثم أضف اثنين من ملليلتر من برنامج تلفزيوني عقيم 2٪ NBCS، مع خلط لطيف، ووضع الأنبوب في المغناطيس لمدة دقيقتين. المضي قدما لجمع كسر غير المغناطيسي مع ماصة المبستر الزجاج العقيم.
وللخطوة الثانية من النضوب المغناطيسي، أضفه إلى 250 ميكرولتر المتبقية من الخرز المغناطيسي. ضع الأنبوب مختوما بالبارافين على أسطوانة أنبوبية ، لمدة 20 دقيقة عند أربع درجات مئوية. ثم أضف اثنين من ملليلتر من برنامج تلفزيوني عقيم 2٪ NBCS مع خلط لطيف.
وضع الأنبوب مع المغناطيس لمدة دقيقتين. جمع الكسر غير المغناطيسي في أنبوب البولي بروبلين خمسة ملليلتر معقمة، وصفت، غير المغناطيسي لين كسر، مع ماصة المعجنات الزجاج العقيم، والمضي قدما في فرز الخلايا megakaryocytes السلف، كما هو موضح في المخطوطة النصية. بالنسبة لاستراتيجية gating لفرز الخلايا ، في السكان لين نيغ ، يتم تحديد الخلايا التي تعبر عن C - عدة ، وانخفاض إلى أي تعبير عن Sca - 1 أو CD16 / 32 مستضد.
في هذه الفئات السكانية، يتم تحديد MEP كخلايا إيجابية CD150 وCD9 باهتة. وMKP كما CD150 إيجابية، وCD9 الخلايا الساطعة. في تحليل التدفق الخلوي التمثيلي ، وصفت الخلايا التي تم تحديدها على أنها MEP و Mkp ، بالأجسام المضادة المترافقة الفلورية ل CD41a ، والعلامات الكلاسيكية CD42c ، للنساب الضخمة والصفائح الدموية.
تم التعبير عن كلتا العينتين من قبل خلايا مجموعة MKp ، ولم يتم اكتشافها على سطح خلايا سكان MEP. محتوى الحمض النووي للخلايا الضخمة فرزها، أظهرت أن الخلايا هي في الغالب 2n للسكان MEP. وجزء صغير من خلايا MKp غريبة.
ولم يتم الكشف عن خلايا الحيل العالية بشكل كبير في هذه المجموعات السكانية. في المقايسات شبه الصلبة الكلونوجينية ، تم الكشف عن CFU-MK في كل من MEP و MKp. لم يتم الكشف عن BFU-E في السكان MKp، ولكن الكشف عنها في MEP و، CD150 السلبي CD9 السكان الخلية السلف خافت.
تظهر الملاحظة المجهرية في اليوم الثالث من التمايز أن MEP و MKp أنتجا خلايا عملاقة بشكل رئيسي ، تم تحديدها كخلايا كبيرة. تم تحديد الخلايا الضخمة التي تم الحصول عليها بعد ثلاثة أيام من الثقافة ، باستخدام تعبير CD41 و CD42c ، وتمثل 54 ، و 82٪ من الخلايا المنتجة من مجموعات خلايا MEP و MKp ، على التوالي. كانت حيلة الخلايا الضخمة المنتجة ، أكبر من الخلايا الضخمة المشتقة من سكان MKp ، وقارنتها بسكان MEP.
فقط الخلايا المشتقة من السكان MKp، كانت قادرة على انبعاث البربليتليت، مما يشير إلى مرحلة نضوج أكثر تقدما للسكان MKp. استخدام عظم الحوض ، يزيد بشكل كبير إلى عدد الخلايا ، في حين أن الاستنفاد المغناطيسي من خطوتين يحسن فعالية استنفاد النسب. يسمح هذا البروتوكول بالثقافة اللاحقة ل MEP و MKp من الخلايا المفردة ، والتي ، إلى جانب التحليل النسخي والبروتيوميكي ، سيتعين عليها بالتأكيد فك رموز الآليات المعنية ، والنشأة الحيوية المنفذة.
