Выделение ключевых популяций-прародителя мегакариоцитов позволяет провести тонкий анализ иерархии линий в клеточной культуре на молекулярных анализах, вплоть до уровня одной клетки. Этот протокол сочетает в себе более этичную практику, сводя к минимуму количество необходимых животных в эффективном процессе сортировки клеток популяций MEP и MKP. Для кости спрей для сбора распылит тело восьми-12-недельной черной шестимышечного C57 с 70% этанолом.
Используйте ножницы, чтобы сделать точечный пяти-сантиметровый разрез кожи, перпендикулярный позвоночнику. И разорвать кожу по всему телу, потянув ее вниз. Поместите мышь лицевой стороной вниз на подушечку для рассечения, затем найдите тазовые кости, скользя пальцами или ножницами, вдоль открытого позвоночника, сверху вниз.
Чтобы найти подвздошный гребень, определите небольшую шишку в поясничной области возле задних конечностей. Положив ножницы параллельно позвоночнику, против позвонков и вплотную к бугоре подвздошного гребня, приступайте к разрезанию мышц вдоль стороны позвоночника над тазовой костью, скользя ножницами вдоль позвонков, вниз к хвосту. Затем разрезают между позвонками и подвздошной гребнем, оставаясь как можно ближе к позвонку.
И отрежьте оставшиеся мышцы, чтобы отсоедать конечность от тела. Перенесите отслоившенные конечности на чистую поверхность. После отбрасывания остальной части тела в соответствии с институциональными рекомендациями используйте щипцы и скальпели, чтобы обнажить тазовые, бедренные и большеберцовые кости, удалив окружающие ткани.
Используйте щипцы, чтобы удерживать дистальный конец бедренной кости, и осторожно вывихнуть головку бедренной кости от тазовой кости, осторожно нарезая мышцы вокруг сочленения скальпелем. Соскоблите оставшуюся мышцу с тазовой кости и вырежьте в середине полости, которая удерживала головку бедренной кости. Сохраните подвздошную кость и отбросьте треугольную тонкую сторону кости.
Используя скальпель, удалите остаточные ткани вокруг подвздошной кости и поместите очищенную кость в стерильный PBS, дополненный сывороткой 2% newborn Calf Serum. Затем с помощью ножниц отрежьте ногу от ноги на лодыжке. Удерживая нижнюю часть большеберцовой кости щипцами, соскоблите мышцу вверх к колену.
Отбросьте малоберцовую киболу. Затем сделайте разрез по большеберцовой кости плато скальпелем и поместите большеберцовую кость в стерильный PBS 2%NBCS. После удаления остаточных тканей вокруг бедренной кости удерживайте верхнюю сторону бедренной кости щипцами, а лезвие скальпеля поместите у основания коленной чашечки.
Приложи усилие к коленной чашечке, параллельно бедренной кости, чтобы отсоедить коленную чашечку. Затем поместите бедренную комочку, в стерильный PBS 2%NBCS. В ламинарной проточной шкафу переложите кости в стерильную чашку Петри, наполненную стерильным PBS 2%NBCS.
Используйте скальпель, чтобы отрезать головку бедренной кости. Наполните шприц на один миллилитр стерильным PBS 2% NBCS и прикрепите к розетке иглу 21 калибра. Затем заполните пятимиллилитровую полипропиленовую трубку двумя миллилитрами стерильного PBS 2%NBCS.
Удерживая бедренную кость щипцами, вставьте иглу в канавку слева, после снятия коленной чашечки, применив вращение, убедившись, что игла полностью вставлена в кость, вплоть до скоса. После введения иглы переведите кость с иглой в трубку, содержащую два миллилитра PBS 2%NBCS. Затем дозируют и аспирируют PBS 2% NBCS, из шприца до тех пор, пока кость не очистится.
Извлеките иглу из бедренной кости, и вставьте ее в отверстие на противоположной стороне, где находилась головка бедренной кости. После дозирования и аспирации буфера отбросьте кость. Для подвздошного гребня и большеберцовой кости используйте щипцы, чтобы удерживать кость и осторожно вставить иглу в открытую сторону, применяя вращение.
Обеспечение того, чтобы игла была полностью вставлена в кость, вплоть до скоса. Затем переведите кость с иглой в трубку, содержащую два миллилитра PBS 2%NBCS. Дозировать и аспирировать PBS 2% NBCS из шприца до тех пор, пока кость не очистится.
Пропустите всю клеточную суспензию через 40-микроновый колпачок клеточного сетчатого фильтра, помещенный на стерильную пятимиллилитровую полистирольную трубку, и добавьте 500 микролитров PBS 2% NBCS. Отложите в сторону 100 микролитров клеточной суспензии в качестве общего костного мозга. Затем храните его на льду для процедуры окрашивания.
Гранулировать фильтрованную суспензию центрифугированием. После выброса супернатанта повторно суспендировать гранулу в свежеприготовленном коктейле первичных антител с инкубацией на льду в течение 30-45 минут. Отложите 10 микролитров клеточной суспензии в стерильную пятимиллилитровую полистирольную трубку с маркировкой Lin Pores Fraction и добавьте 90 микролитров PBS 2% NBCS.
Тем временем подготовьте бусины для магнитного истощения, повторно развернув их во флаконе, с тщательным вихрем в течение 30 секунд. Переложите объем бусин, соответствующий двум шарикам на целевую ячейку, в пятимиллилитровую полипропиленовую трубку и дважды промыть бусины с PBS 2% NBCS, поместив трубку на магнит. После снятия промывного буфера стерильной стеклянной пастерной пипеткой повторно суспендировали бусины в 500 микролитрах стерильного PBS 2%NBCS.
Для первого этапа магнитного истощения добавьте 250 микролитров бусин на гранулу промытых клеток и высиживайте с мягким перемешиванием в течение пяти минут на льду. Затем добавьте два миллилитра стерильного PBS 2%NBCS, с мягким перемешиванием, и поместите трубку в магнит на две минуты. Приступайте к сбору ноголентической фракции стерильной стеклянной пастерной пипеткой.
А для второго шага магнитного истощения добавьте его к оставшимся 250 микролитрам магнитных шариков. Поместите тюбик, запечатанный парафином, на трубчатый валик, на 20 минут при четырех градусах Цельсия. Затем добавьте два миллилитра стерильного PBS 2%NBCS с мягким перемешиванием.
И поместите трубку с магнитом на две минуты. Соберите немагнитную фракцию в стерильную пятимиллилитровую полипропиленовую трубку, меченую, немагнитную фракцию Лин Нег, со стерильной стеклянной пипеткой пастрера и приступайте к сортировке клеток-прародителей мегакариоцитов, как описано в текстовой рукописи. Для стратегии сортировки клеток в популяции Лин Нег выбираются клетки, экспрессирующие С-кит, и низкая или нулевая экспрессия антигена Sca-1 или CD16/32.
В этой популяции MEP идентифицируются как CD150 положительные и CD9 тусклые клетки. MKP как CD150 положительные, так и CD9 яркие клетки. В репрезентативном анализе проточной цитометрии клетки, идентифицированные как MEP и Mkp, были помечены флуоресцентными конъюгированными антителами к CD41a и классическим маркерам CD42c мегакариоцитарных и тромбоцитарных линий.
Оба маркера были экспрессированы клетками популяции MKp и не были обнаружены на поверхности клеток популяции MEP. Содержание ДНК отсортированных мегакариоцитов продемонстрировало, что клетки в основном 2n для популяции MEP. И небольшая часть клеток MKp является чужеродной.
Клетки с более высокой плоидией не были значительно обнаружены в этих популяциях. В полутвердых клоногенных анализах КОЕ-МК был обнаружен как в популяциях MEP, так и mKp. BFU-E не был обнаружен в популяции MKp, но обнаружен в MEP и CD150 отрицательной CD9 популяции клеток-прародителя.
Микроскопические наблюдения на третий день дифференцировки показывают, что MEP и MKp продуцируют в основном мегакариоциты, идентифицированные как крупные клетки. Мегакариоциты, полученные после трех дней культивированности, были идентифицированы с использованием экспрессии CD41 и CD42c и представляют собой 54 и 82% клеток, продуцированных из клеточных популяций MEP и MKp соответственно. Плоидия вырабатываемых мегакариоцитов была больше из мегакариоцитов, полученных из популяции MKp, по сравнению с популяцией MEP.
Только клетки, полученные из популяции MKp, были способны к проплатлетной эмиссии, что предполагает более продвинутую стадию созревания для популяции MKp. Использование тазовой кости резко увеличивает количество клеток, в то время как двухступенчатое магнитное истощение повышает эффективность истощения линии. Этот протокол позволяет проводить последующую культивирование ПОПУЛЯЦИИ MEP и MKp одиночных клеток, которые вместе с транскриптомическим и протеомным анализом непременно должны будут расшифровать задействованные механизмы, реализованные биогенезом.
