L’isolement des populations clés de progéniteurs de mégacaryocytes permet une analyse fine de la hiérarchie de la lignée en culture cellulaire sur des tests moléculaires, jusqu’au niveau de la cellule unique. Ce protocole combine une pratique plus éthique en minimisant le nombre d’animaux requis, dans un processus efficace pour le tri cellulaire des populations de MEP et de MKP. Pour l’os, la collecte pulvérise le corps d’une souris C57 noire six âgée de huit à 12 semaines, avec 70% d’éthanol.
Utilisez des ciseaux pour faire une incision de cinq à un centimètre de la peau, perpendiculaire à la colonne vertébrale. Et déchirer la peau autour de tout le corps, en la tirant vers le bas. Placez la souris face vers le bas sur le coussinet de dissection, puis localisez les os pelviens en faisant glisser des doigts ou des ciseaux, le long de la colonne vertébrale exposée, de haut en bas.
Pour localiser la crête iliaque, identifiez la petite bosse dans la région lombaire près des membres postérieurs. Après avoir placé les ciseaux parallèlement à la colonne vertébrale, contre les vertèbres et près de la bosse de la crête iliaque, procédez à couper les muscles le long du côté de la colonne vertébrale au-dessus de l’os pelvien, en faisant glisser les ciseaux le long des vertèbres, jusqu’à la queue. Ensuite, coupez entre les vertèbres et la crête iliaque, en restant aussi près que possible des vertèbres.
Et coupez les muscles restants pour détacher le membre du corps. Transférez les membres détachés sur une surface propre. Après avoir jeté le reste du corps conformément aux directives de l’établissement, utilisez des forceps et des scalpels pour exposer les os pelviens, fémoraux et tibiaux, en enlevant les tissus environnants.
Utilisez une pince pour maintenir l’extrémité distale du fémur et disloquez soigneusement la tête fémorale de l’os pelvien, en tranchant doucement les muscles autour de l’articulation avec un scalpel. Grattez le muscle restant de l’os pelvien et coupez au milieu de la cavité qui maintenait la tête fémorale. Conservez l’ilium et jetez le côté mince triangulaire de l’os.
À l’aide d’un scalpel, retirez les tissus résiduels autour de l’ilium et placez l’os nettoyé dans du PBS stérile complété par du sérum de veau nouveau-né à 2%. Ensuite, utilisez des ciseaux pour couper le pied de la jambe à la cheville. En tenant la partie inférieure du tibia avec la pince, grattez le muscle vers le genou.
Jetez le péroné. Ensuite, faites une coupe à travers le plateau tibial avec le scalpel et placez le tibia dans pbS stérile 2% NBCS. Après avoir enlevé les tissus résiduels autour du fémur, tenez la face supérieure du fémur avec une pince et placez la lame du scalpel à la base de la rotule.
Appliquez une force vers la rotule, parallèlement au fémur pour détacher la rotule. Placez ensuite le fémur, dans pbS stérile 2% NBCS. Dans une armoire à flux laminaire, transférer les os dans une boîte de Petri stérile remplie de PBS stérile à 2% NBCS.
Utilisez un scalpel pour couper la tête des fémurs. Remplissez une seringue d’un millilitre avec du PBS stérile à 2 % NBCS et fixez une aiguille de calibre 21 à la sortie. Remplissez ensuite un tube en polypropylène de cinq millilitres avec deux millilitres de PBS stérile 2% NBCS.
En tenant le fémur avec une pince, insérez l’aiguille dans la rainure gauche, après le retrait de la rotule en appliquant une rotation, en veillant à ce que l’aiguille soit complètement insérée dans l’os, jusqu’au biseau. Après l’insertion de l’aiguille, transférer l’os avec l’aiguille dans le tube contenant deux millilitres de PBS 2% NBCS. Ensuite, distribuez et aspirez le PBS 2% NBCS, de la seringue jusqu’à ce que l’os soit clair.
Retirez l’aiguille du fémur et insérez-la dans le trou du côté opposé, où se trouvait la tête du fémur. Après avoir distribué et aspiré le tampon, jetez l’os. Pour la crête iliaque et le tibia, utilisez une pince pour maintenir l’os et insérez doucement l’aiguille dans le côté ouvert, en appliquant une rotation.
S’assurer que l’aiguille est complètement insérée dans l’os, jusqu’au biseau. Ensuite, transférez l’os avec l’aiguille dans le tube contenant deux millilitres de PBS 2% NBCS. Distribuer et aspirer le PBS 2% NBCS de la seringue jusqu’à ce que l’os soit clair.
Passez toute la suspension cellulaire à travers un capuchon de crépine cellulaire de 40 microns, placé sur un tube stérile en polystyrène de cinq millilitres, et ajoutez 500 microlitres de PBS 2% NBCS. Réserver 100 microlitres de la suspension cellulaire sous forme de moelle osseuse totale. Ensuite, stockez-le sur de la glace pour la procédure de coloration.
Pelleter la suspension filtrée par centrifugation. Après avoir jeté le surnageant, ressuspendez la pastille dans un cocktail d’anticorps primaires fraîchement préparé, avec l’incubation sur glace, pendant 30 à 45 minutes. Mettez de côté 10 microlitres de la suspension cellulaire dans un tube stérile de cinq millilitres en polystyrène, étiqueté Lin Pores Fraction, et ajoutez 90 microlitres de PBS 2% NBCS.
Pendant ce temps, préparez les perles à l’épuisement magnétique, en les remettant en désessépère dans le flacon, avec un vortex complet pendant 30 secondes. Transférer un volume de billes correspondant à deux perles par cellule cible, dans un tube en polypropylène de cinq millilitres, et laver les perles deux fois, avec PBS 2%NBCS, en plaçant le tube sur l’aimant. Après avoir retiré le tampon de lavage avec une pipette pasteur en verre stérile, resuspendez les billes dans 500 microlitres de PBS stérile 2% NBCS.
Pour la première étape de l’épuisement magnétique, ajoutez 250 microlitres de perles sur la pastille de cellules lavées et incubez en mélangeant doucement pendant cinq minutes sur de la glace. Ajoutez ensuite deux millilitres de PBS stérile 2% NBCS, avec un mélange doux, et placez le tube dans l’aimant pendant deux minutes. Procéder à la collecte de la fraction non magnétique avec une pipette pasteur en verre stérile.
Et pour la deuxième étape de l’épuisement magnétique, ajoutez-le aux 250 microlitres restants de perles magnétiques. Placez le tube scellé avec de la paraffine sur un rouleau à tube, pendant 20 minutes à quatre degrés Celsius. Ajoutez ensuite deux millilitres de PBS stérile 2% NBCS avec un mélange doux.
Et placez le tube avec l’aimant pendant deux minutes. Recueillir la fraction non magnétique dans un tube stérile en polypropylène de cinq millilitres, étiqueté, fraction Lin Neg non magnétique, avec une pipette de pastreur en verre stérile, et procéder au tri cellulaire des progéniteurs de mégacaryocytes, comme décrit dans le manuscrit du texte. Pour la stratégie de contrôle du tri cellulaire, dans la population de Lin Neg, les cellules exprimant C-kit et une expression faible ou nulle de l’antigène Sca-1 ou CD16/32 sont sélectionnées.
Dans cette population, les MEP sont identifiés comme des cellules CD150 positives et CD9 dim. Le MKP comme CD150 positif, et CD9 cellules lumineuses. Dans l’analyse représentative de cytométrie en flux, les cellules identifiées comme MEP et Mkp ont été marquées avec des anticorps conjugués par fluorescence pour CD41a et des marqueurs classiques CD42c des lignées mégacaryocytaires et plaquettaires.
Les deux marqueurs ont été exprimés par les cellules de la population MKp et n’ont pas été détectés à la surface des cellules de la population MEP. La teneur en ADN des mégacaryocytes triés a démontré que les cellules sont principalement 2n pour la population MEP. Et une petite partie des cellules MKp sont étrangères.
Des cellules de ploïdie plus élevées n’ont pas été détectées de manière significative dans ces populations. Dans les essais clonogènes semi-solides, l’UFC-MK a été détectée dans les populations de MEP et de MKp. Le BFU-E n’a pas été détecté dans la population de MKp, mais détecté dans le MEP et la population de cellules progéniteurs CD9 CD9 négatifs CD150.
L’observation microscopique du troisième jour de différenciation, montre que MEP et MKp ont produit principalement des mégacaryocytes, identifiés comme de grandes cellules. Les mégacaryocytes obtenus après trois jours de culture ont été identifiés à l’aide de l’expression de CD41 et CD42c et représentent respectivement 54 et 82 % des cellules produites à partir de populations de cellules MEP et MKp. La ploïdie des mégacaryocytes produits était plus grande à partir du mégacaryocyte dérivé de la population MKp, par rapport à la population MEP.
Seules les cellules dérivées de la population MKp étaient capables d’émission de proplaquettaires, suggérant un stade de maturation plus avancé pour la population MKp. L’utilisation de l’os pelvien augmente considérablement le nombre de cellules, tandis que l’épuisement magnétique en deux étapes améliore l’efficacité de l’épuisement de la lignée. Ce protocole permet la culture ultérieure d’une population de cellules uniques MEP et MKp, qui, avec l’analyse transcriptomique et protéomique, devra certainement déchiffrer les mécanismes impliqués, mis en œuvre la biogenèse.
