分离关键的巨核细胞祖细胞群，可以在分子测定中对细胞培养物中的谱系层次结构进行精细分析，直至单细胞水平。该协议通过最大限度地减少所需的动物数量，在MEP和MKP群体的细胞分选的有效过程中结合了更合乎道德的做法。对于骨骼，收集喷洒8至12周龄C57黑六只小鼠的身体，含70%乙醇。
使用剪刀在皮肤上做一个五到一厘米的切口，垂直于脊柱。然后撕扯整个身体周围的皮肤，把它拉下来。将鼠标面朝下放在解剖垫上，然后通过滑动手指或剪刀沿着暴露的脊柱从上到下定位骨盆骨。
要定位髂嵴，请识别后肢附近腰部区域的小肿块。将剪刀平行于脊柱，贴在椎骨上，并靠近髂嵴凸起后，继续沿着骨盆骨上方的脊柱一侧切割肌肉，方法是将剪刀沿着椎骨向下滑动到尾巴。然后在椎骨和髂嵴之间切开，尽可能靠近椎骨。
并切除剩余的肌肉，使肢体与身体分离。将分离的肢体转移到干净的表面上。按照机构指南丢弃身体的其余部分后，使用镊子和手术刀通过去除周围组织来暴露骨盆，股骨和胫骨。
使用镊子固定股骨远端，并用手术刀轻轻切开关节周围的肌肉，小心地将股骨头与骨盆骨脱臼。刮掉骨盆骨的剩余肌肉，并在支撑股骨头的腔的中间切开。保留髂骨并丢弃骨骼的三角形薄侧。
使用手术刀去除髂骨周围的残留组织，并将清洁的骨头放入补充有2%新生犊牛血清的无菌PBS中。然后用剪刀将脚从脚踝处的腿上切下来。用镊子握住胫骨的下部，将肌肉刮向膝盖。
丢弃腓骨。然后用手术刀切开胫骨平台，并将胫骨置于无菌PBS 2%NBCS中。去除股骨周围的残余组织后，用镊子固定股骨的上侧，并将手术刀刀片放在膝盖骨的底部。
向膝盖骨施加与股骨平行的力以分离膝盖骨。然后将股骨置于无菌PBS 2%NBCS中。在层流柜中，将骨头转移到充满无菌PBS 2%NBCS的无菌培养皿中。
用手术刀切掉股骨头。用无菌PBS 2%NBCS填充一毫升注射器，并将21号针头连接到出口。然后用两毫升无菌PBS 2%NBCS填充五毫升聚丙烯管。
用镊子握住股骨，将针头插入左侧凹槽中，通过旋转去除膝盖骨后，确保针头完全插入骨骼，直至斜角。针头插入后，将用针头将骨头转移到含有两毫升PBS 2%NBCS的管中。然后从注射器分配并抽吸PBS 2%NBCS，直到骨头清晰。
从股骨上取下针头，然后将其插入股骨头所在的另一侧的孔中。分配并吸出缓冲液后，丢弃骨头。对于髂嵴和胫骨，使用镊子固定骨头，并通过旋转轻轻地将针头插入开口侧。
确保针头完全插入骨头，直到斜角。然后将用针头将骨头转移到含有两毫升PBS 2%NBCS的管中。从注射器中分配并抽吸PBS 2%NBCS，直到骨骼清晰。
将所有细胞悬浮液通过40微米的细胞过滤器盖，置于无菌的5毫升聚苯乙烯管上，并加入500微升PBS 2%NBCS。留出100微升细胞悬浮液作为总骨髓。然后将其储存在冰上以进行染色过程。
通过离心沉淀过滤后的悬浮液。弃去上清液后，将沉淀重悬于新鲜制备的一抗混合物中，在冰上孵育30至45分钟。留出10微升细胞悬浮液放入无菌的5毫升聚苯乙烯管中，标记为Lin Pores Fraction，并加入90微升PBS 2%NBCS。
同时，准备一颗用于磁耗竭的珠子，将它们重新悬浮在小瓶中，彻底涡旋30秒。将对应于每个靶细胞两个磁珠的体积转移到五毫升聚丙烯管中，并通过将管放在磁铁上，用PBS 2%NBCS洗涤磁珠两次。用无菌玻璃巴氏移液管除去洗涤缓冲液后，将微珠重悬于500微升无菌PBS 2%NBCS中。
对于磁性耗尽的第一步，将250微升珠子加入洗涤细胞的沉淀中，并在冰上轻轻混合五分钟。然后加入两毫升无菌PBS 2%NBCS，轻轻混合，将管放入磁铁中两分钟。继续使用无菌玻璃巴氏移液器收集非磁性部分。
对于磁耗竭的第二步，将其添加到剩余的250微升磁珠中。将用石蜡密封的管子放在管辊上，在四摄氏度下放置20分钟。然后加入两毫升无菌PBS 2%NBCS，轻轻混合。
并将管子与磁铁放在一起两分钟。将非磁性馏分收集到无菌的五毫升聚丙烯管中，标记，无磁性的Lin Neg级分，用无菌玻璃巴氏移液管，然后继续进行细胞分选巨核细胞祖细胞，如文本手稿中所述。对于用于细胞分选的门控策略，在Lin Neg群体中，选择表达C-试剂盒的细胞以及Sca-1或CD16 / 32抗原的低表达或无表达。
在该群体中，MEP被鉴定为CD150阳性和CD9昏暗细胞。MKP为CD150阳性，且CD9为亮细胞。在具有代表性的流式细胞术分析中，鉴定为MEP和Mkp的细胞被标记为巨核细胞和血小板谱系的CD41a和CD42c经典标记物的荧光偶联抗体。
这两种标记物均由MKp群体的细胞表达，并且在MEP群体的细胞表面未被检测到。分类的巨核细胞的DNA含量表明，MEP群体的细胞大多为2n。MKp细胞的一小部分是外来的。
在这些群体中未显着检测到较高的倍体细胞。在半固体克隆检测中，在MEP和MKp人群中都检测到CFU-MK。BFU-E在MKp群体中未检测到，但在MEP和CD150阴性CD9昏暗的祖细胞群中检测到。
分化第三天的显微观察表明，MEP和MKp主要产生巨核细胞，被鉴定为大细胞。培养三天后获得的巨核细胞使用CD41和CD42c表达进行鉴定，分别代表MEP和MKp细胞群产生的54%和82%的细胞。与MEP群体相比，从MKp群体衍生的巨核细胞中产生的巨核细胞的倍数更大。
只有来自MKp群体的细胞能够发射丙酸盐，这表明MKp群体的成熟阶段更为晚期。骨盆骨的使用急剧增加到细胞数，而两步磁耗竭提高了谱系耗竭的功效。该协议允许随后培养单细胞的MEP和MKp群体，这些细胞与转录组学和蛋白质组学分析一起，肯定必须破译所涉及的机制，实施生物发生。
