تم إنشاء شرائح الأنسجة العضوية من الأنسجة المختلفة. نظرا لسلامة الأنسجة المحفوظة وتطوير تقنيات الزراعة ، فقد كانت مناسبة لنمذجة الآليات الفسيولوجية المعقدة. تعيد مزارع الشرائح العضوية من سرطان البنكرياس عن كثب حساب البنية متعددة الخلايا للورم وبيئته المكروية خارج الجسم الحي.
يمكن استخدامها لمختلف التطبيقات النهائية ، مثل اختبار الاستجابة للأدوية. يمكن زراعتها مباشرة بعد الاستئصال الجراحي للورم ، وهي غير مكلفة وأقل استهلاكا للوقت مقارنة بمعظم تقنيات الاستزراع الأولية الأخرى. ومن بين المبادرين إلى هذا الإجراء، ستكون أولها لابشينا، وهي مساعدة فنية من جامعة لوبيك.
للبدء ، قم بإعداد 100 ملليلتر من 8٪ أغاروز منخفض الذوبان عن طريق إذابة ثمانية جرامات من الأغاروز في 100 ملليلتر من محلول الرنين المسخن مسبقا ، وتخزينه عند أربع درجات مئوية لحين الحاجة. عند الإعلان عن استئصال الورم ، تذوب الأغاروز في الميكروويف. ضع الأغاروز في حمام مائي مسخن مسبقا ، مما يسمح له بالتبريد إلى درجات حرارة فسيولوجية قبل التحضير.
ضع شفرة حلاقة في حامل الاهتزاز وقم بإجراء ضبط تلقائي للزاوية وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. قم بتبريد غلاف غرفة القطع باستخدام وحدة تبريد أو ثلج مبلل. املأ حجرة القطع بحوالي 100 ملليلتر من محلول الرنين ، ثم ضع شفرة الحلاقة المثبتة في محلول القطع المبرد مسبقا ، مما يسمح لشفرة الحلاقة بالتبريد.
اغسل عينة الأنسجة باستخدام برنامج تلفزيوني مبرد وضعها في طبق بتري كبير طوله 14 سم على الجليد. قم بإزالة النسيج الضام الزائد المرئي مجهريا على الجليد باستخدام مشرط. ضع المنديل في طبق بتري صغير.
اضبط اتجاه الأنسجة ، بحيث يكون للنسيج الضام المرئي المجهري المتبقي نفس اتجاه سهل الجزء السفلي من طبق بتري. صب الأغاروز منخفض الذوبان المحضر في طبق بتري الصغير ، مع إعادة ضبط اتجاه الأنسجة. إذا لزم الأمر ، باستخدام ملقط ، ثم ضع طبق بتري على الجليد الرطب لتصلب أسرع من الأغاروز.
قطع الأنسجة بعناية باستخدام مشرط ، وترك ما لا يقل عن خمسة ملليمترات من الأغاروز المحيطة على كل جانب من الأنسجة. أضف الغراء إلى حامل العينة ، وانشره ، وانقل الأنسجة المضمنة وألصقها على حامل العينة باستخدام superglue. بعد بضع ثوان ، ضع حامل العينة في حجرة القطع واضبط اتجاه الأنسجة نحو شفرة الحلاقة إذا لزم الأمر.
حدد الحدود الخارجية لنطاق القطع وفقا لحجم عينة الأنسجة. اضبط الشفرة باتجاه الجزء العلوي من كتلة الأنسجة. اضبط سرعة القطع على 0.04 ملم في الثانية ، وسعة القطع إلى ملليمتر واحد وسمك الشريحة إلى 300 ميكرومتر.
قم بقص الشرائح الأولى بعناية ونقل الشرائح إلى حاوية منفصلة بمحلول جرس مبرد مسبقا على الثلج الرطب. تحضير لوحة من ستة آبار مع ملليلتر واحد من وسط الزراعة المناسب لكل بئر. ضع الصفيحة المكونة من ستة آبار مع الوسط في حاضنة ، مما يسمح بضبط درجة الحرارة ودرجة الحموضة قبل الزراعة.
ضع الشرائح على حشوات زراعة الخلايا باستخدام مرشح النظرة ، ثم قم بإزالة أي محلول رنين زائد عن طريق وضع المرشح المحمل على قطعة قماش معقمة. ضع المرشح المحمل في اللوحة المكونة من ستة آبار دون إضافة أي وسيط إضافي إلى الملحق ، ثم ضع لوحة الآبار الستة في حاضنة وقم بتغيير الوسط كل يومين. ضع مرشح الزراعة مع الشريحة المركبة على طبق بتري.
باستخدام مشرط ، قم بقطع غشاء المرشح بعناية باستخدام شريحة الأنسجة المركبة. انقل غشاء المرشح مع الشريحة المركبة إلى كيس نايلون خزعة وضعه في شريط تضمين. بعد ذلك ، قم بنقل أشرطة التضمين البلاستيكية في حاوية تحتوي على 4.5٪ فورمالين مبرد مسبقا لمدة لا تقل عن 24 ساعة أو حتى الاستخدام مرة أخرى.
اشطف بحذر ثقافة شرائح الفورمالين الثابتة بماء الصنبور الجاري لمدة 1.5 ساعة. تجفيف شريحة الأنسجة الثابتة الفورمالين عن طريق الحضانة في 70 ٪ 95 ٪ والإيثانول المطلق. بعد ذلك ، قم بإزالة شريحة الأنسجة الثابتة من الفورمالين مع حضانتين لمدة ثلاث ساعات في الزيلين.
اغمر المنديل بالبارافين عند 60 درجة مئوية طوال الليل ثم مرة أخرى لمدة ساعتين. قم بتضمين المنديل في كتلة البارافين في قالب تضمين الأنسجة وضعه على الثلج لتبريد العينة بشكل أسرع. قسم كتلة الأنسجة المدمجة في البارافين بسمك أربعة ميكرومتر باستخدام ميكروتوم وفي حمام مائي 40 درجة مئوية يحتوي على ماء مقطر.
نقل الأقسام إلى شرائح زجاجية. احتضان أقسام البارافين لمدة ساعة واحدة عند 60 درجة مئوية لربط الأنسجة بالزجاج. ثم احتضان الشرائح طوال الليل عند 37 درجة مئوية.
إزالة المقاطع عن طريق الحضانة في الزيلين ثلاث مرات لمدة خمس دقائق لكل منها. بعد ذلك ، قم بإعادة الترطيب عن طريق الحضانة المتتالية في الكحول المطلق ، و 95٪ كحول ، و 70٪ كحول. تلطيخ الأقسام في محلول ماير الهيماتوكسيلين لمدة خمس دقائق وشطف بماء الصنبور الجاري لمدة 10 دقائق.
استلق العاكس في محلول ESN 0.5٪ لمدة 40 ثانية واشطفه بالماء المقطر ، ثم كرر الجفاف في الإيثانول. امسح المنديل في ثلاثة تغييرات من الزيلين لبضع ثوان لكل منها ، ثم ضع قطرة من وسيط التثبيت وقم بتغطية الشرائح بقسيمة غطاء. انخفض التشكل العياني لكل OTSC أثناء الزراعة لمدة ستة أيام.
تم حفظ الجدوى ل OTSCs من ورمين أوليين تمثيليين في وسطين مختلفين أظهرا انخفاضا في الصلاحية بعد اليوم صفر بسبب إجراء التقسيم والتكيف مع ظروف الثقافة ، بالإضافة إلى زيادة في صلاحية عينة الورم في اللوحة اليمنى. أظهرت أقسام صبغة H& E أن الهيكل العام للأنسجة قد تم الحفاظ عليه طوال فترة الزراعة خارج الجسم الحي ، وأنه لم يتم الكشف عن أي تغييرات جسيمة في الانتشار وموت الخلايا المبرمج خلال فترة الاستزراع البالغة ستة أيام. لم يكشف التقييم النسيجي المجهري لأقسام H&E عن زيادة كبيرة في نخر جميع الأنسجة المزروعة أثناء الزراعة.
كانت هناك زيادة في الخلايا الإيجابية Caspase-3 المشقوقة بعد زراعة سرطان غدي البنكرياس القنوي الأولي ، أو PDAC ، لمدة 15 يوما. أظهر التشريح المرضي للورم الخبيث البريتوني ل PDAC عدم تجانس عالي داخل الورم بين الشرائح الفردية ، بالإضافة إلى موت الخلايا المبرمج الذي يحدث بشكل طبيعي والذي تم قياسه بواسطة تلطيخ Caspase-3 المشقوق. أظهر تلطيخ H&E والتوصيف المناعي للسيتوكيراتين 7 في ورم خبيث PDAC لجدار البطن أن OTSCs المشتقة لا تحتوي على أي خلايا ورمية ، ولكنها تتكون فقط من النسيج الضام ، الذي كان نخريا جزئيا.
يمكن تحديد ملامح كل شريحة مستزرعة بشكل فردي ، اعتمادا على سؤال البحث المحدد ، على سبيل المثال ، عن طريق تسلسل الحمض النووي الريبي لعلم النسخ أو التصوير المعتدل للبروتينات التي تم حلها مكانيا. في المستقبل ، فإن الجمع بين الأساليب التحليلية غير المدمرة لديه إمكانات كبيرة للتنبؤ بالاستجابات الخاصة بالمريض للأنظمة العلاجية المختلفة.
