原発性膵臓癌および転移における腫瘍微小環境の前臨床モデルとしての器官型スライス培養

器官型組織切片は、種々の組織から作製されている。保存された組織の完全性と培養技術の開発により、複雑な生理学的メカニズムのモデル化に適していました。膵臓癌の器官型スライス培養は、腫瘍とその微小環境の生体外での多細胞構造を厳密に再計算します。

これらは、薬物反応試験など、さまざまなダウンストリームアプリケーションに使用できます。腫瘍の外科的切除直後に培養でき、他のほとんどの一次培養技術と比較して安価で時間もかかりません。この手順を実演するのは、リューベック大学の技術助手であるOlha Lapshynaです。

まず、8グラムのアガロースを100ミリリットルの予熱リンガー溶液に溶解して100ミリリットルの低融点8%アガロースを調製し、必要になるまで摂氏4度で保存します。腫瘍切除の発表が発表されたら、アガロースを電子レンジで溶かします。アガロースを予熱した水浴に入れ、調製前に生理学的な温度まで冷却します。

かみそりの刃をビブラートムのホルダーに入れ、製造元の指示に従って自動角度調整を実行します。カッティングチャンバーのジャケットを冷却ユニットまたはウェットアイスで冷却します。カッティングチャンバーに約100ミリリットルのリンガー溶液を入れ、取り付けたカミソリの刃を事前に冷却したカッティング溶液に入れ、カミソリの刃を冷まします。

組織標本を冷却したPBSで洗浄し、氷上の大きな14cmのシャーレに入れます。氷上で肉眼的に見える余分な結合組織をメスで取り除きます。ティッシュを小さなペトリ皿に入れます。

肉眼的に見える残りの結合組織がペトリ皿の底のプレーンと同じ向きを持つように、組織の向きを調整します。準備した低融点アガロースを小さなシャーレに注ぎ、組織の向きを再調整します。必要に応じて、鉗子を使用して、ペトリ皿を湿った氷の上に置いて、アガロースをより速く硬化させます。

メスを使用して組織を慎重に切断し、組織の両側に少なくとも5ミリメートルの周囲のアガロースを残します。サンプルホルダーに接着剤を付けて広げ、埋め込まれた組織を移し替えて、瞬間接着剤を使用してサンプルホルダーに接着します。数秒後、サンプルホルダーをカッティングチャンバーに入れ、必要に応じて組織の向きをカミソリの刃に向けます。

組織試料のサイズに応じて、切断範囲の外側の限界を定義します。ティッシュブロックの上部に向かってブレードを調整します。切削速度を0.04ミリメートル/秒、切削振幅を1ミリメートル、スライス厚さを300マイクロメートルに設定します。

最初のスライスを慎重にカットし、スライスを湿った氷の上で事前に冷却したリンガー溶液を入れた別の容器に移します。1ウェルにつき1ミリリットルの適切な培養培地が入った6ウェルプレートを調製します。培地を入れた6ウェルプレートをインキュベーターに入れ、培養前に温度とpHを調整します。

ゲイズフィルターを使用して細胞培養インサートにスライスを置き、ロードしたフィルターを滅菌布の上に置いて余分なリンガー溶液を取り除きます。インサートに培地を追加せずに、準備した6ウェルプレートにロードしたフィルターを入れ、6ウェルプレートをインキュベーターに入れて、2日ごとに培地を交換します。スライスを取り付けた培養フィルターをペトリ皿に置きます。

メスで、取り付けられたティッシュスライスでフィルター膜を慎重に切り取ります。スライスを取り付けたフィルターメンブレンを生検ナイロンバッグに移し、埋め込みカセットに入れます。その後、プラスチック埋め込みカセットを、事前に冷却した4.5%ホルマリンを入れた容器に、最低24時間またはさらに使用するまで移します。

ホルマリン固定スライス培養物を流水で1.5時間慎重にすすぎます。ホルマリン固定組織切片を70%95%および無水エタノール中でインキュベートすることにより脱水する。次に、ホルマリン固定組織スライスをキシレンで2回の3時間インキュベーションで透明にします。

組織をパラフィンに摂氏60度で一晩浸し、その後再び2時間浸します。組織包埋型内のパラフィンブロックに組織を埋め込み、氷上に置いてサンプルをより速く冷却します。パラフィン包埋組織ブロックを厚さ4マイクロメートルでミクロトームで切片化し、蒸留水を含む摂氏40度の水浴中で作製します。

切片をスライドガラスに移します。パラフィン切片を摂氏60度で1時間インキュベートし、組織をガラスに結合します。次に、スライドを摂氏37度で一晩インキュベートします。

キシレンで3回、それぞれ5分間インキュベートすることにより、切片を脱パラフィンします。その後、無水アルコール、95%アルコール、70%アルコールで連続的にインキュベートして再水和します。切片をMayerヘマトキシリン溶液で5分間染色し、水道水で10分間すすぎます。

0.5%ESN溶液で40秒間対比染色し、蒸留水ですすぎ、エタノールで脱水を繰り返します。キシレンの3つの交換で組織をそれぞれ数秒間透明にしてから、封入剤を一滴垂らし、スライドをカバースリップで覆います。各OTSCの巨視的形態は、6日間の培養中に減少した。

生存率は、2つの異なる培地の2つの代表的な原発腫瘍からのOTSCについて保存され、切片化手順と培養条件への調整により、0日目後の生存率の低下、および右側のパネルの腫瘍標本の生存率の増加を示しました。H&E染色切片は、組織の全体的な構造がex vivoでの培養の全期間にわたって保存され、6日間の培養期間中に増殖とアポトーシスの肉眼的変化が検出されなかったことを示しました。H&E切片の顕微鏡的病理組織学的評価では、培養中のすべての培養組織の壊死の実質的な増加は明らかにされませんでした。

原発性膵管腺がん(PDAC)を15日間培養した後、切断されたカスパーゼ-3陽性細胞が増加しました。PDACの腹膜転移の組織病理学は、個々のスライス間の腫瘍内不均一性が高いこと、および切断されたカスパーゼ-3染色によって測定される自然発生的なアポトーシスを示しました。腹壁のPDAC転移におけるサイトケラチン7のH&E染色および免疫組織学的特性評価により、誘導されたOTSCには腫瘍細胞は含まれておらず、部分的に壊死した結合組織のみで構成されていることが示されました。

各培養スライスは、特定の研究課題に応じて、例えばトランスクリプトミクスのRNAシーケンシングや空間分解プロテオミクスのマイルドイメージングなどにより、個別にプロファイリングすることができます。将来的には、非破壊分析法との組み合わせにより、さまざまな治療レジメンに対する患者固有の反応を予測する大きな可能性を秘めています。