Fatias de tecido organotípico foram geradas a partir de vários tecidos. Devido à integridade tecidual preservada e ao desenvolvimento de técnicas de cultivo, elas têm sido adequadas para modelar mecanismos fisiológicos complexos. Culturas de fatias organotípicas de carcinomas pancreáticos recalculam de perto a arquitetura multicelular do tumor e seu microambiente ex vivo.
Eles podem ser usados para várias aplicações a jusante, como testes de resposta a medicamentos. Eles podem ser cultivados imediatamente após a ressecção cirúrgica do tumor e são baratos e menos demorados em comparação com a maioria das outras técnicas de cultura primária. Demonstrando o procedimento estará Olha Lapshyna, assistente técnica da Universidade de Lübeck.
Para começar, prepare 100 mililitros de agarose a 8% de baixo ponto de fusão, dissolvendo oito gramas de agarose em 100 mililitros de solução de campainha pré-aquecida e armazene-a a quatro graus Celsius até que seja necessário. Após o anúncio da ressecção do tumor, derreta a agarose no micro-ondas. Coloque a agarose em banho-maria pré-aquecido, deixando-a esfriar até temperaturas fisiológicas antes do preparo.
Coloque uma lâmina de barbear no suporte do Vibratome e execute um ajuste de ângulo automatizado de acordo com as instruções do fabricante. Resfrie a camisa da câmara de corte usando uma unidade de resfriamento ou gelo úmido. Encha a câmara de corte com aproximadamente 100 mililitros de solução de campainha e, em seguida, coloque a lâmina de barbear montada na solução de corte pré-resfriada, permitindo que a lâmina de barbear esfrie.
Lave a amostra de tecido com PBS resfriado e coloque-a em uma grande placa de Petri de 14 centímetros no gelo. Remova o excesso de tecido conjuntivo macroscopicamente visível no gelo usando um bisturi. Coloque o tecido em uma pequena placa de Petri.
Ajuste a orientação do tecido, de modo que o tecido conjuntivo macroscopicamente visível restante tenha a mesma orientação que a planície do fundo da placa de Petri. Despeje a agarose de baixo ponto de fusão preparada na pequena placa de Petri, reajustando a orientação do tecido. Se necessário, usando uma pinça, coloque a placa de Petri no gelo úmido para um endurecimento mais rápido da agarose.
Corte cuidadosamente o tecido usando um bisturi, deixando pelo menos cinco milímetros de agarose circundante em cada lado do tecido. Adicione cola ao porta-amostras, espalhe-o e transfira o tecido embutido e cole-o no porta-amostras usando supercola. Após alguns segundos, coloque o porta-amostras na câmara de corte e ajuste a orientação do tecido em direção à lâmina de barbear, se necessário.
Defina os limites externos da faixa de corte de acordo com o tamanho da amostra de tecido. Ajuste a lâmina em direção ao topo do bloco de tecido. Defina a velocidade de corte para 0,04 milímetros por segundo, a amplitude de corte para um milímetro e a espessura da fatia para 300 micrômetros.
Corte cuidadosamente as primeiras fatias e transfira as fatias para um recipiente separado com solução de campainha pré-resfriada em gelo úmido. Prepare uma placa de seis poços com um mililitro do meio de cultivo apropriado por poço. Coloque a placa de seis poços com o meio em uma incubadora, permitindo que a temperatura e o pH se ajustem antes do cultivo.
Coloque as fatias nas inserções de cultura de células usando um filtro de olhar e, em seguida, remova o excesso de solução de campainha colocando o filtro carregado em um pano estéril. Coloque o filtro carregado na placa de seis poços preparada sem adicionar nenhum meio adicional ao inserto, depois coloque a placa de seis poços em uma incubadora e troque o meio a cada dois dias. Coloque o filtro de cultivo com a fatia montada em uma placa de Petri.
Com um bisturi, corte cuidadosamente a membrana do filtro com a fatia de tecido montada. Transfira a membrana do filtro com a fatia montada para um saco de náilon de biópsia e coloque-o em um de incorporação. Em seguida, transfira os de incorporação de plástico em um recipiente com formalina a 4,5% pré-resfriada por um período mínimo de 24 horas ou até uso posterior.
Enxágue cuidadosamente a cultura de fatias fixas de formalina com água corrente da torneira por 1,5 horas. Desidrate a fatia de tecido fixado em formalina por incubação em etanol absoluto 70% 95% e absoluto. Em seguida, limpe a fatia de tecido fixado em formalina com duas incubações de três horas em xileno.
Mergulhe o tecido com parafina a 60 graus Celsius durante a noite e depois novamente por duas horas. Incorpore o tecido em um bloco de parafina em um molde de incorporação de tecido e coloque-o no gelo para resfriar a amostra mais rapidamente. Corte o bloco de tecido embebido em parafina com espessura de quatro micrômetros com um micrótomo e em banho-maria a 40 graus Celsius contendo água destilada.
Transfira as seções para lâminas de vidro. Incube seções de parafina por uma hora a 60 graus Celsius para unir o tecido ao vidro. Em seguida, incube as lâminas durante a noite a 37 graus Celsius.
Desparafinizar seções por incubação em xileno três vezes por cinco minutos cada. Em seguida, reidratar por incubações sucessivas em álcool absoluto, álcool 95% e álcool 70%. Manchar as secções com solução de Hematoxilina Mayer durante cinco minutos e enxaguar com água corrente da torneira durante 10 minutos.
Contra-corar em solução de 0,5% ESN por 40 segundos e enxaguar com água destilada, depois repetir a desidratação em etanol. Limpe o tecido em três trocas de xileno por alguns segundos cada, depois coloque uma gota de meio de montagem e cubra as lâminas com uma lamínula. A morfologia macroscópica de cada CTST diminuiu durante o cultivo por seis dias.
A viabilidade é salva para OTSCs de dois tumores primários representativos em dois meios diferentes mostrou uma diminuição na viabilidade após o dia zero devido ao procedimento de secção e ajuste às condições de cultura, bem como um aumento na viabilidade da amostra do tumor no painel direito. As seções de coloração de H&E mostraram que a estrutura geral do tecido foi preservada durante todo o tempo de cultivo ex vivo, e que nenhuma alteração macroscópica de proliferação e apoptose foi detectada durante o período de cultivo de seis dias. A avaliação histopatológica microscópica dos cortes de H&E não revelou um aumento substancial na necrose de todos os tecidos cultivados durante o cultivo.
Houve um aumento de células positivas para Caspase-3 clivadas após o cultivo de um adenocarcinoma ductal pancreático primário, ou PDAC, por 15 dias. A histopatologia de uma metástase peritoneal de um PDAC demonstrou uma alta heterogeneidade intratumoral entre cortes individuais, bem como apoptose natural medida pela coloração de Caspase-3 clivada. A coloração H&E e a caracterização imunohistológica da citoqueratina 7 em uma metástase PDAC da parede abdominal mostraram que as OTSCs derivadas não continham células tumorais, mas consistiam apenas em tecido conjuntivo, que era parcialmente necrótico.
Cada fatia cultivada pode ser perfilada individualmente, dependendo da questão de pesquisa específica, por exemplo, por sequenciamento de RNA para transcriptômica ou imagem leve para proteômica espacialmente resolvida. No futuro, a combinação com métodos analíticos não destrutivos tem grande potencial para prever respostas específicas do paciente a diferentes regimes terapêuticos.
