器官型切片培养作为原发性胰腺癌和转移瘤肿瘤微环境的临床前模型

器官型组织切片是由各种组织产生的。由于保存的组织完整性和培养技术的发展，它们一直适用于模拟复杂的生理机制。胰腺癌的器官型切片培养物密切地重新计算了肿瘤的多细胞结构及其离体微环境。

它们可用于各种下游应用，例如药物反应测试。它们可以在手术切除肿瘤后立即培养，与大多数其他主要培养技术相比，价格低廉且耗时更少。来自吕贝克大学的技术助理奥尔哈·拉普希纳（Olha Lapshyna）将演示该程序。

首先，通过将 8 克琼脂糖溶解在 100 毫升预热的林格溶液中来制备 100 毫升低熔点 8% 琼脂糖，并将其储存在 4 摄氏度直至需要。在宣布肿瘤切除后，将琼脂糖在微波炉中融化。将琼脂糖放入预热的水浴中，使其冷却至生理温度，然后再制备。

将剃须刀片放入振动切片机的支架中，并根据制造商的说明执行自动角度调整。使用冷却装置或湿冰冷却切割室的夹套。用大约 100 毫升林格溶液填充切割室，然后将安装的剃须刀片放入预冷的切割溶液中，让剃须刀片冷却。

用冷却的PBS洗涤组织标本，并将其放入冰上的14厘米大培养皿中。使用手术刀去除冰上肉眼可见的多余结缔组织。将组织放入一个小培养皿中。

调整组织方向，使剩余的宏观可见结缔组织与培养皿底部的平原具有相同的方向。将准备好的低熔点琼脂糖倒入小培养皿中，重新调整组织的方向。如果需要，使用镊子，然后将培养皿放在湿冰上，以更快地硬化琼脂糖。

用手术刀小心地切割组织，在组织的每一侧留下至少五毫米的周围琼脂糖。将胶水添加到样品架上，铺开，然后转移嵌入的组织并使用强力胶将其粘在样品架上。几秒钟后，将样品架放入切割室，并在需要时调整组织朝向剃须刀片的方向。

根据组织标本的大小定义切割范围的外部极限。将刀片调整到组织块的顶部。将切割速度设置为每秒 0.04 毫米，切割幅度为 1 毫米，切片厚度为 300 微米。

小心地切开第一片，然后将切片转移到一个单独的容器中，该容器装有预冷的林格溶液，放在湿冰上。准备一个六孔板，每孔含有一毫升适当的培养基。将装有培养基的六孔板放入培养箱中，在培养前调节温度和 pH 值。

使用凝视过滤器将切片放在细胞培养插入物上，然后通过将加载的过滤器放在无菌布上来去除任何多余的林格溶液。将加载的过滤器放入准备好的六孔板中，而不向插入物中添加任何额外的培养基，然后将六孔板放入培养箱中，每两天更换一次培养基。将带有已安装切片的培养过滤器放在培养皿上。

用手术刀，小心地切开带有安装的组织切片的滤膜。将带有安装切片的滤膜转移到活检尼龙袋中，并将其放入包埋盒中。随后，将塑料包埋盒转移到装有预冷的 4.5% 福尔马林的容器中至少 24 小时或直到进一步使用。

用流动的自来水小心冲洗福尔马林固定切片培养物 1.5 小时。将福尔马林固定组织切片在70%95%和无水乙醇中孵育脱水。然后，在二甲苯中孵育两次三小时，清除福尔马林固定组织切片。

将组织与石蜡在 60 摄氏度下浸泡过夜，然后再次浸泡两个小时。将组织包埋在组织包埋模具中的石蜡块中，并将其置于冰上以更快地冷却样品。用切片机和含有蒸馏水的 40 摄氏度水浴将石蜡包埋的组织块切片为 4 微米厚。

将切片转移到载玻片上。将石蜡切片在 60 摄氏度下孵育一小时，以将组织粘合到玻璃上。然后，将载玻片在 37 摄氏度下孵育过夜。

通过在二甲苯中孵育 3 次，每次 5 分钟对切片进行脱蜡。然后，通过在无水酒精、95% 酒精和 70% 酒精中连续孵育来补充水化。在Mayer苏木精溶液中染色切片5分钟，然后用流动的自来水冲洗10分钟。

在0.5%ESN溶液中复染40秒，用蒸馏水冲洗，然后在乙醇中重复脱水。用二甲苯分三次清洗组织，每次几秒钟，然后放置一滴封固剂，并用盖玻片盖住载玻片。各OTSC的宏观形态在培养6 d期间均有所下降。

在两种不同培养基中保存的两种代表性原发性肿瘤的 OTSC 的存活率显示，由于切片程序和对培养条件的调整，第 0 天后存活率下降，以及右图中肿瘤标本的活力增加。H&E 染色切片显示，在离体培养的整个过程中，组织的整体结构保持不变，并且在 6 天的培养期间未检测到增殖和凋亡的严重变化。H&E 切片的显微镜组织病理学评估未显示培养过程中所有培养组织的坏死显着增加。

培养原发性胰腺导管腺癌 （PDAC） 15 天后，裂解的 Caspase-3 阳性细胞增加。PDAC 腹膜转移的组织病理学显示，单个切片之间的瘤内异质性很高，并且通过裂解的 Caspase-3 染色测量了自然发生的细胞凋亡。腹壁PDAC转移中Cytokeratin 7的H&E染色和免疫组织学表征表明，衍生的OTSCs不含任何肿瘤细胞，而仅由结缔组织组成，结缔组织部分坏死。

根据特定的研究问题，每个培养的切片都可以单独进行分析，例如，通过RNA测序进行转录组学分析，或通过轻度成像进行空间分辨蛋白质组学分析。将来，与非破坏性分析方法的结合在预测患者对不同治疗方案的特异性反应方面具有很大的潜力。