Fette di tessuto organotipiche sono state generate da vari tessuti. Grazie alla preservata integrità dei tessuti e allo sviluppo di tecniche di coltivazione, sono stati adatti per modellare meccanismi fisiologici complessi. Le colture di fette organotipiche di carcinomi pancreatici ricalcolano attentamente l'architettura multicellulare del tumore e del suo microambiente ex vivo.
Possono essere utilizzati per varie applicazioni a valle, come i test di risposta ai farmaci. Possono essere coltivati immediatamente dopo la resezione chirurgica del tumore e sono economici e richiedono meno tempo rispetto alla maggior parte delle altre tecniche di coltura primaria. A dimostrare la procedura sarà Olha Lapshyna, assistente tecnico dell'Università di Lubecca.
Per iniziare, prepara 100 millilitri di agarosio all'8% a basso punto di fusione sciogliendo otto grammi di agarosio in 100 millilitri di soluzione di ringer preriscaldata e conservalo a quattro gradi Celsius fino al momento del bisogno. All'annuncio della resezione del tumore, sciogliere l'agarosio in un forno a microonde. Porre l'agarosio a bagnomaria preriscaldato, lasciandolo raffreddare a temperature fisiologiche prima della preparazione.
Posizionare una lama di rasoio nel supporto del vibratomo ed eseguire una regolazione automatica dell'angolo secondo le istruzioni del produttore. Raffreddare la camicia della camera di taglio utilizzando un'unità di raffreddamento o ghiaccio umido. Riempire la camera di taglio con circa 100 millilitri di soluzione di ringer, quindi posizionare la lama di rasoio montata nella soluzione di taglio pre-raffreddata, lasciando raffreddare la lama di rasoio.
Lavare il campione di tessuto con PBS raffreddato e metterlo in una grande capsula di Petri da 14 centimetri su ghiaccio. Rimuovere il tessuto connettivo in eccesso macroscopicamente visibile sul ghiaccio utilizzando un bisturi. Metti il fazzoletto in una piccola capsula di Petri.
Regolare l'orientamento del tessuto, in modo che il tessuto connettivo macroscopicamente visibile rimanente abbia lo stesso orientamento del piano del fondo della capsula di Petri. Versare l'agarosio a basso punto di fusione preparato nella piccola capsula di Petri, regolando nuovamente l'orientamento del tessuto. Se necessario, usando una pinza, posizionare la capsula di Petri su ghiaccio umido per un indurimento più rapido dell'agarosio.
Tagliare con cura il tessuto usando un bisturi, lasciando almeno cinque millimetri di agarosio circostante su ciascun lato del tessuto. Aggiungere la colla al portacampioni, stenderla e trasferire il tessuto incorporato e incollarlo sul portacampioni utilizzando la supercolla. Dopo alcuni secondi, posizionare il portacampione nella camera di taglio e, se necessario, regolare l'orientamento del tessuto verso la lama del rasoio.
Definire i limiti esterni dell'intervallo di taglio in base alle dimensioni del campione di tessuto. Regolare la lama verso la parte superiore del blocco di tessuto. Impostare la velocità di taglio a 0,04 millimetri al secondo, l'ampiezza di taglio a un millimetro e lo spessore della fetta a 300 micrometri.
Tagliare con cura le prime fette e trasferirle in un contenitore separato con soluzione ringer pre-raffreddata su ghiaccio umido. Preparare una piastra a sei pozzetti con un millilitro del terreno di coltura appropriato per pozzetto. Posizionare la piastra a sei pozzetti con il terreno in un'incubatrice, consentendo alla temperatura e al pH di regolare prima della coltivazione.
Posizionare le fette sugli inserti delle colture cellulari utilizzando un filtro per lo sguardo, quindi rimuovere la soluzione di suoneria in eccesso posizionando il filtro caricato su un panno sterile. Posizionare il filtro caricato nella piastra a sei pozzetti preparata senza aggiungere alcun mezzo aggiuntivo all'inserto, quindi posizionare la piastra a sei pozzetti in un incubatore e cambiare il mezzo ogni due giorni. Posizionare il filtro di coltivazione con la fetta montata su una capsula di Petri.
Con un bisturi, ritagliare con cura la membrana filtrante con la fetta di tessuto montata. Trasferire la membrana filtrante con la fetta montata in una sacca di nylon per biopsia e posizionarla in una cassetta di inclusione. Successivamente, trasferire le cassette di inclusione in plastica in un contenitore con formalina pre-raffreddata al 4,5% per un minimo di 24 ore o fino a nuovo utilizzo.
Sciacquare con cautela la coltura a fette fisse in formalina con acqua corrente del rubinetto per 1,5 ore. Disidratare la fetta di tessuto fissata in formalina mediante incubazione in etanolo al 70% 95% e assoluto. Quindi, pulire la fetta di tessuto fissato in formalina con due incubazioni di tre ore in xilene.
Immergere il fazzoletto con paraffina a 60 gradi Celsius per una notte e poi di nuovo per due ore. Incorporare il tessuto in un blocco di paraffina in uno stampo per incorporare il tessuto e posizionarlo sul ghiaccio per raffreddare il campione più velocemente. Sezionare il blocco di tessuto incluso in paraffina a uno spessore di quattro micrometri con un microtomo e in un bagno d'acqua a 40 gradi Celsius contenente acqua distillata.
Trasferire le sezioni su vetrini. Incubare le sezioni di paraffina per un'ora a 60 gradi Celsius per legare il tessuto al vetro. Quindi, incubare i vetrini per una notte a 37 gradi Celsius.
Deparaffinare le sezioni mediante incubazione in xilene tre volte per cinque minuti ciascuna. Quindi, reidratare mediante incubazioni successive in alcol assoluto, alcol al 95% e alcol al 70%. Macchiare le sezioni con la soluzione di ematossilina Mayer per cinque minuti e risciacquare con acqua corrente del rubinetto per 10 minuti.
Controcolorare in soluzione di ESN allo 0,5% per 40 secondi e risciacquare con acqua distillata, quindi ripetere la disidratazione in etanolo. Pulire il tessuto in tre cambi di xilene per pochi secondi ciascuno, quindi posizionare una goccia di mezzo di montaggio e coprire i vetrini con un vetrino coprioggetti. La morfologia macroscopica di ciascun OTSC è diminuita durante la coltivazione per sei giorni.
L'invitalità è salvata per gli OTSC di due tumori primari rappresentativi in due diversi terreni che hanno mostrato una diminuzione della vitalità dopo il giorno zero a causa della procedura di sezionamento e dell'aggiustamento alle condizioni di coltura, nonché un aumento della vitalità del campione tumorale nel pannello destro. Le sezioni di colorazione H&E hanno mostrato che la struttura complessiva del tessuto è stata preservata per tutto il tempo di coltivazione ex vivo e che non sono stati rilevati cambiamenti grossolani di proliferazione e apoptosi durante il periodo di coltura di sei giorni. La valutazione istopatologica microscopica delle sezioni H&E non ha rivelato un aumento sostanziale della necrosi di tutti i tessuti coltivati durante la coltivazione.
C'è stato un aumento delle cellule caspasi-3-positive scisse dopo aver coltivato un adenocarcinoma duttale pancreatico primario, o PDAC, per 15 giorni. L'istopatologia di una metastasi peritoneale di un PDAC ha dimostrato un'elevata eterogeneità intratumorale tra le singole fette, così come l'apoptosi naturale misurata mediante colorazione con Caspasi-3 scissata. La colorazione H&E e la caratterizzazione immunoistologica della citocheratina 7 in una metastasi PDAC della parete addominale hanno mostrato che le OTSC derivate non contenevano cellule tumorali, ma consistevano solo di tessuto connettivo, che era parzialmente necrotico.
Ogni fetta coltivata può essere profilata individualmente, a seconda della specifica domanda di ricerca, ad esempio mediante sequenziamento dell'RNA per la trascrittomica o imaging lieve per la proteomica risolta spazialmente. In futuro, la combinazione con metodi analitici non distruttivi ha un grande potenziale per prevedere le risposte specifiche del paziente a diversi regimi terapeutici.
