Il nostro protocollo presenta uno strumento ottimizzato per studiare il cuore del pesce zebra in vivo e descrive le tecniche di immobilizzazione dell'incorporamento insieme alla pipeline di acquisizione e analisi dei dati per l'imaging cardiaco. Zebrafish è un sistema modello cardiaco con un grande potenziale per applicazioni come lo schermo farmacologico. Il protocollo che consente l'imaging delicato in condizioni fisiologiche è fondamentale quando si studiano le malattie cardiache.
Il flusso di lavoro qui presentato si concentra sull'imaging cardiaco embrionale del pesce zebra, ma una versione modificata può essere applicata a vari altri campioni ed esperimenti, tra cui calamari, vermi e idra. Inizia raccogliendo gli embrioni ottenuti dall'allevamento delle linee transgeniche desiderate. Tenere gli embrioni a 28 gradi Celsius in una capsula di Petri piena di mezzo di pesce E3.
Utilizzare un ago di vetro montato su un micromanipolatore e collegato a un iniettore pico per iniettare 30 picogrammi di mRNA alfa-bungarotossina nel tuorlo di uno o due embrioni allo stadio cellulare per immobilizzare il pesce. Conservare le uova a 28 gradi Celsius in una capsula di Petri riempita con mezzo E3 e trasferire le uova ogni 24 ore in un nuovo piatto contenente un mezzo E3 fresco fino all'imaging. Per prevenire la formazione di pigmenti, se lo sfondo del pesce zebra non è albino, trasferire il pesce a 25 ore dopo la fecondazione in un nuovo piatto contenente E3 medium con inibitore della tirosinasi da 0,2 millimole 1-fenil 2-tiourea, noto anche come PTU.
Per raddrizzare il tubo di etilene propilene fluorurato, posizionare il tubo in un tubo di vetro o acciaio sicuro per autoclave con il diametro interno corretto per adattarsi ai tubi polimerici e all'autoclave a 180 gradi Celsius per due ore. Una volta che i tubi raggiungono la temperatura ambiente, rimuovere il tubo polimerico raddrizzato. Per la pulizia del tubo, utilizzare una siringa da 50 millimetri per lavare il tubo due volte con un molare di idrossido di sodio.
Tagliare il tubo alle dimensioni di un tubo di centrifuga da 50 millilitri, metterlo in un tubo centrifuga riempito con 0,5 molari di idrossido di sodio e ultrasuonato per 10 minuti. Lavare il tubo di etilene propilene fluorurato con acqua doppia distillata, seguita da etanolo al 70%. Tubi di trasferimento un tubo di centrifuga fresco conteneva il 70% di etanolo e ultrasuoni per 10 minuti.
Dopo l'ultrasuoni, sciacquare il tubo per l'ultima volta con acqua distillata doppia e conservarlo in un tubo centrifugo contenente acqua doppia distillata. Dopo aver sciolto l'agarosio a basso punto di fusione nel mezzo E3, versare l'agarosio fuso in una capsula di Petri di vetro o plastica per ottenere una mano da uno a due millimetri. Una volta solidificato l'agarosio, versare delicatamente il mezzo E3 sulla parte superiore dell'agar per evitare l'essiccazione.
Sigillare la piastra con pellicola di paraffina e conservare a quattro gradi Celsius. Scongelare la soluzione madre di tricaina e aggiungere lo 0,02% di tricaina al mezzo E3 senza blu di metile da utilizzare come mezzo di incorporamento. Utilizzare una pipetta di vetro usa e getta per trasferire il pesce al mezzo di incorporamento.
Verificare che il pesce abbia smesso di muoversi e che il cuore batta a una velocità simile rispetto al controllo. Tagliare il tubo di etilene propilene fluorurato alla lunghezza ideale con una lama di rasoio. Preparare una siringa con una cannula smussata.
Riempire la siringa con aria, quindi montare il tubo sull'ago e sciacquare delicatamente l'acqua rimanente svuotando la siringa. Quindi, riempire il tubo di etilene propilene fluorurato montato su una siringa con i media. Inserire un embrione nel tubo, tenendo la testa del pesce vicino all'estremità del tubo, evitando la formazione di bolle.
Usando una lama di rasoio, tagliare con cura il tubo sul bordo della cannula smussata o dell'ago. Dopo aver scartato qualsiasi liquido sulla parte superiore del piatto rivestito di agar, immergere il tubo direttamente nell'agar. Ruotare il tubo ed estrarlo per rilasciare la spina dal letto di agarosio.
Verificare la presenza del tappo di agar all'estremità del tubo. Per l'imaging a lungo termine, tagliare da tre a cinque fori nel tubo in ogni direzione cardinale, almeno cinque millimetri sopra l'estremità del pesce posizionando una lama di rasoio perpendicolare all'asse del tubo e praticare un'incisione nel tubo a 30 gradi fino a raggiungere il supporto di montaggio. Quindi, fai una seconda incisione a 180 gradi per creare un foro e fai rotolare il tubo per visualizzare chiaramente i tagli.
Trasferire l'embrione montato in un tubo microcentrifuga da 1,5 millilitri contenente supporti incorporanti fino a quando non sarà pronto per l'immagine. Montare il tubo nel portacampioni e riempire la camera di imaging con supporti incorporanti. Posizionare il portacampioni sul palco con il campione immerso nella camera.
Controlla la salute dei pesci incorporati valutando visivamente la frequenza cardiaca e se il battito cardiaco è troppo lento scarta il campione. Utilizzare sempre la stessa posizione del campione per immagini riproducibili e ruotare il pesce in modo che entrambi gli occhi si trovino sul piano focale. Quindi, ruotare il pesce di circa 20-30 gradi in senso antiorario per 48 ore dopo l'imaging della fecondazione.
Quando il pesce si è adattato alla potenza del laser, selezionare il lato di illuminazione che offre la migliore qualità dell'immagine. Su ogni piano Z, registra da quattro a cinque battiti cardiaci a 300 fotogrammi al secondo o più. Per registrare il cuore che batte, spostare il campione gradualmente attraverso il foglio luminoso e utilizzare una spaziatura Z di uno o due micrometri per coprire l'intera profondità del cuore.
Carica il file 4D in un software di rendering 3D per esplorare i dati e generare filmati del cuore di zebrafish renderizzato. A 48 ore dopo la fecondazione il cuore ha appena subito un looping e ha due camere, il ventricolo e l'atrio, ma deve ancora sviluppare le valvole. Le diverse strutture cardiache come il ventricolo, il canale atrioventricolare, l'atrio, il tratto di afflusso e il tratto di deflusso sono facilmente distinguibili.
I dati hanno indicato un battito preciso e hanno rivelato interazioni complesse tra i due strati cellulari del cuore, il miocardio, un singolo strato muscolare cellulare che si contrae e genera forza, e l'endocardio, un singolo strato cellulare che collega il cuore alla vascolarizzazione. Il più importante è verificare sempre lo stato del campione e il battito cardiaco costante sotto uno stereoscopio. Mentre le tecniche convenzionali spesso influenzano la forma o la funzione del cuore, i nostri metodi ci forniscono dati dinamici e imperturbabili del cuore che batte che ci aiutano a capire gli elementi essenziali del cuore embrionale precoce.
