该协议解决了痰液处理过程中遇到的常见挑战，这些挑战在过去使得流式细胞术难以用于高通量临床诊断目的。该协议旨在通过使用痰量来确定抗体和染料染色量来节省时间。在染色孵育期间，可以对下游步骤进行细胞计数。
重要的是要实现准确的细胞计数，以确定正确的再悬浮液体积，以防止在流式细胞仪上运行时出现任何问题。该协议可以提供对研究肺部健康的研究领域的见解。例如，可以研究COPD，哮喘，肺癌或COVID的影响等疾病。
演示该程序的将是Michael Lai博士，他是我实验室的研发科学家。首先，称量痰液样本以确定解离试剂的体积。根据痰液重量将样品转移到适当大小的血管中，然后每克0.5%NAC加入一毫升，每克0.1%DTT加入四毫升。
在室温下以最大速度涡旋样品15秒，以最大速度摇摆15分钟。用4X Hanks平衡盐溶液或HBSS稀释该样品，以中和NAC和DTT。快速涡旋后，在室温下摇动样品五分钟。
通过100微米尼龙网状细胞过滤器过滤细胞悬浮液到一个或多个50毫升锥形离心管中，以产生单细胞悬浮液。将细胞向下沉淀。吸出上清液后，将沉淀物混合在一个15毫升的锥形管中，并在相同的条件下用HBSS洗涤。
将细胞沉淀重悬于由痰液样品的初始重量确定的缓冲液体积中。从细胞悬浮液中取出等分试样，将10微升痰液稀释液与30微升0.4%台盼蓝混合，然后装入血细胞计数器的计数室进行活/死细胞计数。在补偿管中标记痰液。
如文中所示，将HBSS抗体和染料添加到每个痰细胞管和补偿管中。如文中所述，将痰细胞添加到测定管中，并将补偿珠添加到补偿管中。将所有管子在冰上避光35分钟。
然后，在用冰冷的HBSS填充管后，以800倍G在4摄氏度下离心10分钟，对于补偿管，吸出上清液尽可能靠近颗粒并轻拂颗粒以松动。接下来，将0.5毫升冷HBSS加入补偿管中，并将管子储存在冰上，在轻度保护区，直到需要流式细胞术分析。然后从未染色的痰液、同种型、血液和上皮管中吸出上清液。
通过轻拂管子松开颗粒。向未染色的和同种型管中加入2毫升1%PFA，向血液和上皮管中加入10毫升。将管子以轻度保护的方式在冰上孵育30分钟，然后以最大速度快速涡旋，然后再次孵育30分钟。
然后用冰冷的HBSS填充管子。接下来，在4摄氏度下离心管10分钟，以1，600倍G.A吸出尽可能多的上清液而不干扰细胞沉淀，并用手指轻拂管以松开细胞，然后将200微升冷的HBSS加入未染色的和同种型管中。根据总细胞计数计算并添加血液和上皮管重悬所需的HBSS体积。
将所有样品储存在补偿管中，以防四摄氏度的冰上避光，直到进行流式细胞术分析。对正在使用的流式细胞仪应用适当的启动程序。使用美国国家标准与技术研究院或 NIST 磁珠的混合物，确保将正向散射和侧向散射电压设置为将 NIST 磁珠放置在跨图中，而不会将磁珠放置在离轴太近的位置。
对于 LSRII，将流速设置为中等流量，对于 Navios EX，将流速设置为高。调整用于散射和荧光参数的每个参数的电压，以按比例放置细胞群。使用带有门控策略的数字作为指导，相应地调整电压。首先获取未染色的痰液样本的数据，然后获取同种型染色样本的数据，然后获取血管和上皮管。
痰液重量用于测定用于染色的抗体或染料体积。痰量与细胞产量的相关性不强。痰液样本分为4个重量类，在细胞产量分布中聚类。
选择在平台相上以具有最高染色指数的浓度滴定使用的每种抗体作为工作浓度。在所有重量类别中，平均SEC污染小于20%，显示活细胞的百分比。介绍的是用于分析的门控策略。
NIST珠子用于设置一个门，该门应用于痰液样本以消除碎片。宽度门进一步消除了小碎片。活性染料用于消除死细胞，而单线态门去除双偶氮。
抗CD45抗体标记允许将活的单个痰细胞分离到血细胞和非血细胞室中。比较了从Navios EX，LSRII和Lyric获得的配置文件。图中显示了用于消除碎片、死细胞、双联物以及比较血液和非血液剖面的门控策略。
这项技术使我们能够应用这些方法来检测肺癌风险，以用作非侵入性临床试验。
