Este protocolo resolve desafios comuns experimentados com o processamento de escarro que tornaram difícil no passado o uso com citometria de fluxo para fins de diagnóstico clínico de alto rendimento. Este protocolo foi projetado para economizar tempo usando peso de escarro para determinar volumes de manchas de anticorpos e corantes. Durante a incubação de manchas, a contagem de células pode ser realizada para as etapas a jusante.
É importante obter uma contagem de células precisa para determinar o volume correto de re-suspensão para evitar quaisquer problemas ao executar no cítmetro de fluxo. Este protocolo pode fornecer informações sobre áreas de pesquisa que investigam a saúde pulmonar. Por exemplo, doenças como DPOC, asma, câncer de pulmão ou os efeitos do COVID poderiam ser estudadas.
Demonstrando o procedimento estará o Dr. Michael Lai, um cientista de pesquisa e desenvolvimento do meu laboratório. Para começar, pese a amostra de escarro para determinar os volumes dos reagentes de dissociação. Transfira a amostra para o vaso de tamanho apropriado com base no peso da escarro, em seguida, adicione um mililitro por grama de 0,5% NAC e quatro mililitros por grama de 0,1%DTT.
Vórtice as amostras em velocidade máxima por 15 segundos e rocha a velocidade máxima por 15 minutos à temperatura ambiente. Diluir esta amostra com a solução de sal balanceada 4X Hanks ou HBSS para neutralizar o NAC e o DTT. E depois de um rápido vórtice, balance a amostra à temperatura ambiente por cinco minutos.
Filtrar a suspensão celular através de um coador de células de malha de nylon de 100 micrômetros em um ou mais tubos de centrífuga cônica de 50 mililitros para criar uma suspensão unicelular. Pelota pelas celas. Depois de aspirar o supernasce, combine pelotas em um tubo cônico de 15 mililitros e lave com HBSS nas mesmas condições.
Resuspengem a pelota celular em um volume de tampão determinado pelo peso inicial da amostra de escarro. Pegue uma alíquota da suspensão celular e misture 10 microlitres da diluição da escarro com 30 microliters de azul trypan de 0,4%, em seguida, carregue nas câmaras de contagem de um hemocitômetro para uma contagem de células vivas/mortas. Etiquetar escarro em tubos de compensação.
Adicione anticorpo HBSS e corante a cada tubo de célula de escarro e tubos de compensação conforme indicado no texto. Adicione as células de escarro aos tubos de ensaio e adicione contas de compensação aos tubos de compensação mencionados no texto. Incubar todos os tubos no gelo protegidos da luz por 35 minutos.
Em seguida, depois de encher os tubos com HBSS gelado, centrífuga a quatro graus Celsius por 10 minutos a 800 vezes G.Para tubos de compensação, aspire o supernatante o mais próximo possível das pelotas e aperte as pelotas para soltar. Em seguida, adicione 0,5 mililitros de HBSS frios aos tubos de compensação e armazene os tubos no gelo em uma área protegida por luz até que seja necessário para a análise da citometria de fluxo. Em seguida, aspire o supernatante da escarro sem manchas, isótipo, sangue e tubos epiteliais.
Solte as pelotas apertando os tubos. Adicione dois mililitros de 1%PFA aos tubos de isótipo e isótipo não contidos e 10 mililitros ao sangue e tubos epiteliais. Incubar os tubos no gelo de forma protegida pela luz por 30 minutos, depois rapidamente vórtice em velocidade máxima e incubar novamente por mais 30 minutos.
Em seguida, encha os tubos com HBSS gelado. Em seguida, centrifugar os tubos a quatro graus Celsius por 10 minutos a 1.600 vezes G.Aspirar o máximo de supernascer possível sem perturbar a pelota celular e mexer o tubo com os dedos para soltar as células, em seguida, adicionar 200 microliters de HBSS frios aos tubos não manchados e isótipo. Calcule e adicione o volume necessário de HBSS para a ressuspensão do sangue e do tubo epitelial de acordo com a contagem total de células.
Armazene todas as amostras em tubos de compensação protegidos da luz no gelo a quatro graus Celsius até que a análise da citometria de fluxo seja realizada. Aplique procedimentos de inicialização adequados para o cítmetro de fluxo que está sendo utilizado. Use a mistura de contas do Instituto Nacional de Padrões e Tecnologia ou NIST para garantir que as tensões de dispersão dianteira e dispersão lateral sejam definidas para colocar as contas NIST para cobrir o enredo sem colocar as contas muito perto dos eixos.
Defina a taxa de fluxo para médio para LSRII ou alta para Navios EX. Ajuste as tensões para cada parâmetro utilizado para os parâmetros de dispersão e fluorescentes para colocar as populações celulares em escala. Use os números com a estratégia de gating como orientação para ajustar as tensões de acordo. Adquira os dados da amostra de escarro não manchada primeiro, seguido pela amostra manchada de isótipo, e depois o tubo sanguíneo e o tubo epitelial.
O peso da escória foi usado para determinar os volumes de anticorpos ou corantes para coloração. A correlação entre peso de escarro e rendimento celular não foi forte. As amostras de escarro foram divididas em quatro categorias de peso, agrupadas na distribuição do rendimento celular.
Cada anticorpo utilizado foi titulado em uma concentração na fase do planalto com o maior índice de coloração foi escolhido como concentração de trabalho. Em todas as categorias de peso, a contaminação média da SEC foi inferior a 20% com o percentual de células viáveis mostradas. Apresentada é a estratégia de gating utilizada para análise.
Contas NIST foram usadas para definir um portão que foi aplicado à amostra de escarro para eliminar detritos. Pequenos detritos foram ainda eliminados pelo portão de largura. O corante de viabilidade foi usado para eliminar células mortas, enquanto o portão singlet removeu doublets.
A rotulagem de anticorpos anti-CD45 permitiu a separação de células de escarro única vivas em uma célula sanguínea e um compartimento de células não-sanguíneas. Os perfis obtidos entre Navios EX, LSRII e Lyric foram comparados. A estratégia de gating para eliminar os detritos, células mortas, dobras e comparar perfis sanguíneos e não-sanguíneos é mostrada.
Esta técnica nos permitiu aplicar esses métodos para detectar o risco de câncer de pulmão para uso como um teste clínico não invasivo.
