Этот протокол решает общие проблемы, возникающие при обработке мокроты, которые в прошлом затрудняли использование с проточной цитометрией для высокопроизводительных клинических диагностических целей. Этот протокол предназначен для экономии времени за счет использования веса мокроты для определения объемов окрашивания антител и красителей. Во время окрашивания инкубации может быть выполнен подсчет клеток для последующих этапов.
Важно достичь точного количества клеток, чтобы определить правильный объем повторной суспензии, чтобы предотвратить любые проблемы при работе на проточном цитометре. Этот протокол может дать представление о областях исследований, которые исследуют здоровье легких. Например, могут быть изучены такие заболевания, как ХОБЛ, астма, рак легких или последствия COVID.
Демонстрировать процедуру будет доктор Майкл Лай, ученый-исследователь из моей лаборатории. Для начала взвесьте образец мокроты, чтобы определить объемы диссоциационных реагентов. Перенесите образец в сосуд соответствующего размера в зависимости от веса мокроты, затем добавьте один миллилитр на грамм 0,5% NAC и четыре миллилитра на грамм 0,1% DTT.
Вращайте образцы на максимальной скорости в течение 15 секунд и породу на максимальной скорости в течение 15 минут при комнатной температуре. Разбавьте этот образец 4X сбалансированным солевым раствором Хэнкса или HBSS для нейтрализации NAC и DTT. А после быстрого вихря качайте образец при комнатной температуре в течение пяти минут.
Фильтрационная клеточная суспензия через 100-микрометровый нейлоновый сетчатый сетчатый фильтр в одну или несколько конических центрифужных трубок по 50 миллилитрам для создания одноэлектрической суспензии. Гранулируйте ячейки. После аспирации супернатанта смешайте гранулы в одной конической трубке объемом 15 миллилитров и промывайте HBSS в тех же условиях.
Повторно суспендируют ячейку гранулы в объеме буфера, определяемом начальным весом образца мокроты. Возьмите аликвоту из клеточной суспензии и смешайте 10 микролитров разведения мокроты с 30 микролитрами 0,4% трипанового синего цвета, затем загрузите в счетные камеры гемоцитометра для подсчета живых/мертвых клеток. Этикетирование мокроты в компенсационных трубках.
Добавьте антитела HBSS и краситель в каждую трубку клетки мокроты и компенсационные трубки, как указано в тексте. Добавьте ячейки мокроты в пробирки и добавьте компенсационные шарики к компенсационным трубкам, как указано в тексте. Высиживать все тюбики на льду, защищенном от света, в течение 35 минут.
Затем, заполнив трубки ледяным холодом HBSS, центрифугируют при четырех градусах Цельсия в течение 10 минут в 800 раз больше G. Для компенсационных трубок аспирируйте супернатант как можно ближе к гранулам и щелкните гранулами, чтобы ослабить. Затем добавьте 0,5 миллилитра холодного HBSS в компенсационные трубки и храните трубки на льду в легкой защищенной зоне до тех пор, пока не понадобится анализ проточной цитометрии. Затем аспирируют супернатант из неокрашенной мокроты, изотипа, крови и эпителиальных трубок.
Ослабьте гранулы, щелкнув трубками. Добавьте два миллилитра 1% PFA к неокрашенным и изотипным пробиркам и 10 миллилитрам в кровь и эпителиальные трубки. Инкубируйте трубки на льду в светозащитной манере в течение 30 минут, затем быстро вихрьте на максимальной скорости и снова высиживайте еще 30 минут.
Затем наполните трубки ледяным холодом HBSS. Далее центрифугируют трубки при четырех градусах Цельсия в течение 10 минут в 1,600 раз больше G.Аспират как можно больше супернатанта, не нарушая гранулу клетки, и щелкают трубкой пальцами, чтобы ослабить клетки, затем добавляют 200 микролитров холодного HBSS в неокрашенные и изотипные трубки. Рассчитайте и сложите необходимый объем HBSS для повторного суспензии крови и эпителиальной трубки в соответствии с общим количеством клеток.
Храните все образцы в компенсационных трубках, защищенных от света на льду при четырех градусах Цельсия, до тех пор, пока не будет выполнен анализ проточной цитометрии. Примените соответствующие процедуры запуска для используемого проточного цитометра. Используйте смесь бусин Национального института стандартов и технологий или NIST, чтобы гарантировать, что напряжения прямого рассеяния и бокового рассеяния установлены для размещения бусин NIST для охвата участка, не помещая бусины слишком близко к осям.
Установите скорость потока на среднюю для LSRII или высокую для Navios EX. Отрегулируйте напряжение для каждого параметра, используемого для параметров рассеяния и флуоресцентных параметров, чтобы поместить популяции клеток в масштабе. Используйте цифры со стратегией гатинга в качестве руководства для соответствующей регулировки напряжения. Сначала соберите данные для неокрашенного образца мокроты, затем образца, окрашенного изотипом, а затем пробирки крови и эпителиальной трубки.
Масса мокроты использовалась для определения объемов антител или красителей для окрашивания. Корреляция между массой мокроты и выходом клеток не была сильной. Образцы мокроты были разделены на четыре весовые категории, которые группировались в распределении выхода клеток.
Каждое использованное антитело титровали в концентрации на фазе плато с самым высоким индексом окрашивания, выбранным в качестве рабочей концентрации. Во всех весовых категориях среднее загрязнение SEC составляло менее 20% при процентном соотношении жизнеспособных клеток. Представлена стратегия гатинга, используемая для анализа.
Бусины NIST использовались для установки ворот, которые были применены к образцу мокроты для устранения мусора. Мелкий мусор был дополнительно устранен шириной ворот. Краситель жизнеспособности использовался для устранения мертвых клеток, в то время как синглетные ворота удаляли дублеты.
Маркировка антител против CD45 позволила разделить живые одиночные клетки мокроты на клетку крови и некремянный клеточный компартмент. Сравнивались профили, полученные от Navios EX, LSRII и Lyric. Показана стратегия уничтожения мусора, мертвых клеток, дублетов и сравнения профилей крови и не крови.
Эта методика позволила применить эти методы для выявления риска рака легких для использования в качестве неинвазивного клинического теста.
