Este protocolo resuelve los desafíos comunes experimentados con el procesamiento del esputo que han dificultado en el pasado su uso con citometría de flujo para fines de diagnóstico clínico de alto rendimiento. Este protocolo está diseñado para ahorrar tiempo mediante el uso del peso del esputo para determinar los volúmenes de tinción de anticuerpos y colorantes. Durante la incubación de la tinción, se puede realizar el recuento de células para los pasos posteriores.
Es importante lograr un recuento preciso de células para determinar el volumen correcto de resuspensión para evitar cualquier problema al funcionar en el citómetro de flujo. Este protocolo puede proporcionar información sobre las áreas de investigación que investigan la salud pulmonar. Por ejemplo, se podrían estudiar enfermedades como la EPOC, el asma, el cáncer de pulmón o los efectos del COVID.
Demostrando el procedimiento estará el Dr. Michael Lai, un científico de investigación y desarrollo de mi laboratorio. Para empezar, pese la muestra de esputo para determinar los volúmenes de reactivos de disociación. Transfiera la muestra al recipiente del tamaño adecuado en función del peso del esputo, luego agregue un mililitro por gramo de 0.5% NAC y cuatro mililitros por gramo de 0.1% TDT.
Vórtice las muestras a la velocidad máxima durante 15 segundos y roca a la velocidad máxima durante 15 minutos a temperatura ambiente. Diluya esta muestra con 4X Hanks balanced salt solution o HBSS para neutralizar el NAC y la TDT. Y después de un vórtice rápido, meca la muestra a temperatura ambiente durante cinco minutos.
Filtre la suspensión de celdas a través de un colador de células de malla de nylon de 100 micrómetros en uno o más tubos de centrífuga cónica de 50 mililitros para crear una suspensión de una sola celda. Peletizar por las células. Después de aspirar el sobrenadante, combine los gránulos en un tubo cónico de 15 mililitros y lávese con HBSS en las mismas condiciones.
Resuspend el pellet celular en un volumen de tampón determinado por el peso inicial de la muestra de esputo. Tome una alícuota de la suspensión celular y mezcle 10 microlitros de la dilución de esputo con 30 microlitros de azul de tripano al 0.4%, luego cargue en las cámaras de conteo de un hemocitómetro para un recuento de células vivas / muertas. Etiquete el esputo en tubos de compensación.
Agregue anticuerpos y colorantes HBSS a cada tubo de células de esputo y tubos de compensación como se indica en el texto. Agregue las células de esputo a los tubos de ensayo y agregue cuentas de compensación a los tubos de compensación como se menciona en el texto. Incubar todos los tubos en hielo protegidos de la luz durante 35 minutos.
Luego, después de llenar los tubos con HBSS helado, centrífuga a cuatro grados Celsius durante 10 minutos a 800 veces G.Para tubos de compensación, aspire el sobrenadante lo más cerca posible de los gránulos y mueva los gránulos para aflojar. A continuación, agregue 0.5 mililitros de HBSS frío a los tubos de compensación y almacene los tubos en el hielo en un área protegida ligera hasta que sea necesario para el análisis de citometría de flujo. Luego aspire el sobrenadante del esputo sin teñir, el isotipo, la sangre y los tubos epiteliales.
Afloje los gránulos moviendo los tubos. Agregue dos mililitros de 1% de PFA a los tubos no teñidos e isotipos y 10 mililitros a la sangre y los tubos epiteliales. Incubar los tubos en hielo de una manera ligeramente protegida durante 30 minutos, luego vórtice rápidamente a la velocidad máxima y nuevamente incubar durante otros 30 minutos.
Luego llene los tubos con HBSS helado. A continuación, centrifugue los tubos a cuatro grados Celsius durante 10 minutos a 1, 600 veces G.Aspire la mayor cantidad de sobrenadante posible sin perturbar la bolita celular y mueva el tubo con los dedos para aflojar las células, luego agregue 200 microlitros de HBSS frío a los tubos no manchados e isotipo. Calcule y agregue el volumen requerido de HBSS para la resuspensión de la sangre y el tubo epitelial de acuerdo con el recuento total de células.
Almacene todas las muestras en tubos de compensación protegidos de la luz en el hielo a cuatro grados centígrados hasta que se realice el análisis de citometría de flujo. Aplique los procedimientos de arranque apropiados para el citómetro de flujo que se está utilizando. Utilice la mezcla de perlas del Instituto Nacional de Estándares y Tecnología o NIST para asegurarse de que los voltajes de dispersión hacia adelante y de dispersión lateral estén configurados para colocar las cuentas NIST para abarcar la parcela sin colocar las cuentas demasiado cerca de los ejes.
Establezca el caudal en medio para LSRII o alto para Navios EX. Ajuste los voltajes para cada parámetro utilizado para los parámetros de dispersión y fluorescentes para colocar las poblaciones celulares en escala. Utilice las figuras con la estrategia de cierre como guía para ajustar los voltajes en consecuencia. Adquiera datos para la muestra de esputo no teñida primero, seguida de la muestra teñida con isotipo, y luego el tubo sanguíneo y el tubo epitelial.
El peso del esputo se utilizó para determinar los volúmenes de anticuerpos o colorantes para la tinción. La correlación entre el peso del esputo y el rendimiento celular no fue fuerte. Las muestras de esputo se dividieron en cuatro categorías de peso, que se agruparon en la distribución del rendimiento celular.
Cada anticuerpo utilizado se tituló en una concentración en la fase de meseta con el índice de tinción más alto se eligió como concentración de trabajo. En todas las categorías de peso, la contaminación promedio de SEC fue inferior al 20% con el porcentaje de células viables mostrado. Se presenta la estrategia de cierre utilizada para el análisis.
Las cuentas del NIST se utilizaron para establecer una puerta que se aplicó a la muestra de esputo para eliminar los escombros. Los escombros pequeños fueron eliminados aún más por la puerta de ancho. El tinte de viabilidad se utilizó para eliminar las células muertas, mientras que la puerta singlete eliminó los dobletes.
El marcado de anticuerpos anti-CD45 permitió la separación de células vivas de esputo único en una célula sanguínea y un compartimento sin células sanguíneas. Se compararon los perfiles obtenidos de Navios EX, LSRII y Lyric. Se muestra la estrategia de cierre para eliminar los escombros, las células muertas, los dobletes y comparar los perfiles sanguíneos y no sanguíneos.
Esta técnica nos permitió aplicar estos métodos para detectar el riesgo de cáncer de pulmón para su uso como prueba clínica no invasiva.
