このプロトコルは、従来、高スループットの臨床診断目的でフローサイトメトリーで使用することが困難になった喀痰処理で経験した一般的な課題を解決します。このプロトコルは、痰の重量を使用して抗体と染色染色量を決定することで時間を節約するように設計されています。染色インキュベーションの間、下流工程に対して細胞数を行うことができる。
フローサイトメーターでの動作時に問題が発生するのを防ぐために、正確なセルカウントを達成して正しい再懸濁液量を決定することが重要です。このプロトコルは、肺の健康を調査する研究分野に関する洞察を提供することができます。例えば、COPD、喘息、肺癌、またはCOVIDの影響などの病気を研究することができます。
この手順のデモンストレーションは、私の研究室の研究開発科学者であるマイケル・ライ博士です。まず、痰サンプルの重量を量って解離試薬の量を決定します。痰の重量に基づいて適切なサイズの容器にサンプルを移し、0.5%NACのグラム当たり1ミリリットル、0.1%DTTのグラム当たり4ミリリットルを加えます。
最高速度で15秒間、最高速度でサンプルを渦を出し、室温で15分間最高速度で揺れ動きます。このサンプルを4Xハンクスバランス塩溶液またはHBSSで希釈して、NACとDTTを中和します。そして、迅速な渦の後、室温でサンプルを5分間揺らします。
フィルターセルサスペンションは、100マイクロメートルのナイロンメッシュセルストレーナーを通して、1つ以上の50ミリリットルの円錐型遠心分離チューブに入り、単一細胞懸濁液を作成します。細胞をペレットダウンします。上清を吸引した後、15ミリリットル円錐形チューブにペレットを組み合わせ、同じ条件でHBSSで洗浄します。
細胞ペレットを、痰サンプルの初期重量によって決定されるバッファーの体積で再懸濁する。細胞懸濁液からアリコートを取り、0.4%トリパンブルーの30マイクロリットルで痰希釈の10マイクロリットルを混合し、生きている/死んだ細胞数のためにヘモサイトメーターの計数室にロードする。補償管のラベルの痰。
テキストに示されているように、HBSS抗体と色素を各喀痰細胞チューブおよび補償チューブに追加します。痰細胞をアッセイチューブに加え、テキストに記載されているように補償チューブに補償ビーズを追加します。氷上のすべてのチューブを35分間、光から保護してインキュベートします。
その後、氷冷HBSSでチューブを充填した後、800倍のG.補償チューブで10分間摂氏4度で遠心分離機、ペレットにできるだけ近い上清を吸引し、ペレットをフリックして緩めます。次に、0.5ミリリットルの冷たいHBSSを補償管に加え、フローサイトメトリー分析に必要になるまで氷上のチューブを光保護領域に保管します。次いで、上清を、染色されていない痰、アイソタイプ、血液、および上皮管から吸引する。
チューブをフリックしてペレットを緩めます。1%PFAの2ミリリットルを未染色およびアイソタイプチューブに加え、血液および上皮管に10ミリリットルを加えます。氷上のチューブを光保護された方法で30分間インキュベートし、最高速度で素早く渦を出し、さらに30分間再びインキュベートします。
その後、氷冷HBSSでチューブを充填します。次に、細胞ペレットを乱さずに10分間、600倍のG.吸入体で摂氏4度でチューブを遠心分離し、指でチューブをフリックして細胞を緩め、200マイクロリットルの冷たいHBSSを未染色およびアイソタイプチューブに加えます。総細胞数に従って血液および上皮管の再懸濁のためにHBSSの必要な容積を計算し、加える。
フローサイトメトリー解析が行われるまで、氷上の光から保護された補償管に全てのサンプルを摂氏4度で保存します。使用しているフローサイトメーターに対して適切な起動手順を適用します。国立標準技術研究所またはNISTビーズを混合して、前方散乱電圧と側面散乱電圧を設定して、ビーズを軸に近づけずにプロットにスパンするようにNISTビーズを配置します。
LSRII の場合は流量を中に設定し、Navios EX の場合は高に設定します。散乱パラメータと蛍光パラメータに使用する各パラメータの電圧を調整して、細胞集団をスケールに配置します。それに応じて電圧を調整するためのガイダンスとして、ゲージ戦略を持つ数字を使用してください。最初に未染色痰サンプルのデータを取得し、次いでアイソタイプ染色サンプル、次に血液管および上皮管を取得する。
痰重量を用いて、染色用の抗体または色素量を決定した。痰の重さと細胞収量の相関は強くはなかった。痰サンプルは、細胞収量の分布に集まった4つの重量カテゴリに分けられた。
使用した各抗体は、最も高い染色指数を有する高原相上濃度で滴定し、働き濃度として選択した。すべての重量カテゴリーにおいて、平均SEC汚染は20%未満であり、生存細胞の割合が示された。提示は、分析に使用される格言戦略です。
NISTビーズは、破片を除去するために痰サンプルに適用されたゲートを設定するために使用されました。小さな破片は、幅のゲートによってさらに排除されました。生存性染料は死んだ細胞を排除するために使用され、シングルゲートはダブレットを除去した。
抗CD45抗体標識により、生きた単一喀痰細胞を血液細胞および非血液細胞区画に分離することができた。ナビオスEX、LSRII、およびリリックから得られたプロファイルを比較した。破片、死んだ細胞、ダブレットを排除し、血液と非血液プロファイルを比較するための格言戦略が示されている。
この技術は、これらの方法を適用して、非侵襲的な臨床検査として使用するための肺癌リスクを検出することを可能にしました。
