تساعد طريقتنا في توليد وفهم بيانات التعبير الجيني من الأنسجة المعقدة على مستوى الخلية الواحدة. يمكن تطبيق طريقتنا بشكل أساسي على أي نسيج بنفس الطريقة وتؤدي إلى بيانات عالية الجودة مع القليل جدا من القطع الأثرية المتعلقة بالبروتوكول. سنقدم أنا والدكتورة جانا ليز من مختبر شميدت أوت البروتوكول.
ابدأ بوضع الكلى على صفيحة تشريح باردة واستخدم مشرطا حادا أو شفرة حلاقة للحصول على شريحة متوسطة من واحد إلى ملليمترين. تأكد من أن قطعة الأنسجة تحتوي على محور الكورتيكوميديا النخاعي بأكمله. استخدم مقص التشريح المجهري والملقط لتقليم القشرة بعناية من جوانب القطعة المركزية.
داخل قطعة الأنسجة المشرحة ، يجب أن تكون الأجزاء الثلاثة القشرة والنخاع الخارجي والنخاع الداخلي مرئية بوضوح. نقل قطعة الكلى إلى محلول تثبيت الحمض النووي الريبي المعد مسبقا واحتضانها لمدة 24 ساعة عند أربع درجات مئوية لتجنب تدهور الحمض النووي الريبي. بعد 24 ساعة ، قم بإزالة محلول تثبيت الحمض النووي الريبي.
قم بإزالة المحلول الزائد بعناية باستخدام مناديل ورقية وقم بتخزين الأنسجة في درجة حرارة 80 درجة مئوية تحت الصفر حتى الاستخدام مرة أخرى. خذ قطعة الكلى المجمدة وانقلها إلى طبق بتري من البوليسترين المبرد مسبقا مقاس 60 ملم على ثلج يحتوي على ملليلتر واحد من Nuclei Lysis Buffer 1 أو NLB1. فرم الأنسجة جيدا باستخدام شفرة حلاقة أو مشرط.
اقطع طرف طرف ماصة سعة ملليلتر واحد وانقل المنديل المفروم والمخزن المؤقت إلى أنبوب المطحنة الموضوع على الجليد. تأكد من نقل جميع القطع ، اغسل طبق بتري من خمس إلى 10 مرات باستخدام المخزن المؤقت. حرك المدقة ببطء 25 مرة لأعلى ولأسفل في أنبوب المطحنة على الجليد لتجانس التعليق.
مرر التجانس من خلال مصفاة 100 ميكرومتر في أنبوب تجميع 15 ملليلتر مبرد مسبقا على الجليد واغسل المرشح بمليلتر آخر من NLB1. اغسل أنبوب المطحنة بمحلول تحلل نوى EZ البارد وتخلص من المخزن المؤقت. انقل المجانس مرة أخرى إلى أنبوب المطحنة وحرك المدقة B ببطء 15 مرة لأعلى ولأسفل في أنبوب المطحنة على الجليد لتجانس التعليق.
انقل التجانس إلى أنبوب تجميع سعة 15 ملليلتر مبرد مسبقا على الجليد. اغسل أنبوب المطحنة بملليلتر آخرين من NLB1 ، وتأكد من نقل جميع شظايا الأنسجة إلى أنبوب التجميع. احتضان التجانس لمدة خمس دقائق على الجليد لتحلل الخلايا.
مرر التجانس من خلال مصفاة 40 ميكرومتر إلى أنبوب تجميع سعة 15 ملليلتر مبرد مسبقا. قم بتدوير أنبوب التجميع لمدة خمس دقائق عند 500 مرة G عند أربع درجات مئوية في جهاز طرد مركزي مع دوار دلو متأرجح. في غضون ذلك ، أضف محلول مثبط RNase إلى NLB2.
قم بإزالة المادة الطافية دون إزعاج الحبيبات. أعد تعليق الحبيبات بعناية في أربعة ملليلتر من NLB2. قم بتغطية التعليق بعناية بوسادة سعة ملليلتر واحد من العازلة المتدرجة للسكروز.
قم بتدوير التعليق عند 500 مرة G لمدة خمس دقائق عند أربع درجات مئوية في جهاز طرد مركزي مع دوار دلو متأرجح. وفي الوقت نفسه ، أضف محلول مثبط RNase إلى المخزن المؤقت لتعليق النوى. بعد الطرد المركزي ، قم بإزالة أنبوب التجميع برفق من جهاز الطرد المركزي ، مع الحرص على عدم إزعاج الطبقتين عند التعامل مع أنبوب التجميع.
يمكن ملاحظة حطام الخلية بين الطبقتين. قم بإزالة المادة الطافية بعناية ، بدءا من الحطام. قم بإزالة المادة الطافية المتبقية دون إزعاج حبيبات النوى وأعد تعليق الحبيبات بعناية في ملليلتر واحد من المخزن المؤقت لتعليق النوى.
مرر التجانس من خلال مصفاة 20 ميكرومتر في أنبوب تجميع فرز الخلايا المبرد مسبقا والمنشط بالفلورة سعة خمسة ملليلترات. تم رسم عدد الجينات مقابل عدد النسخ المحددة بواسطة معرفات جزيئية فريدة وملونة بجزء من قراءات الميتوكوندريا لتقييم جودة النوى المعزولة. تم اكتشاف ما مجموعه 20،000 جين في 6،000 نواة مع 1،600 جين متوسط و 2،800 متوسط معرفات جزيئية فريدة لكل نواة.
تم تصور أنماط التعبير الجيني للعلامات المخصبة بالكتلة باستخدام مخطط نقطي ، ومجموعات نوع الخلية في مخطط تضمين جار عشوائي موزع على شكل حرف T. تم حساب النسبة المئوية لكل نوع من الخلايا واستخدامها لتحديد نسبة النبيبات القريبة إلى خلايا الأطراف الصاعدة السميكة. من الأهمية بمكان العمل عند أربع درجات مئوية في جميع الأوقات وتحديد الكمية المثلى من الأنسجة في التجارب لضمان تعليق عالي الجودة وتركيزات مثالية.
