Наш метод помогает генерировать и понимать данные экспрессии генов из сложных тканей на уровне отдельных клеток. Наш метод может быть применен практически к любой ткани таким же образом и приводит к высококачественным данным с очень небольшим количеством артефактов, связанных с протоколом. Доктор Жанна Лейц и я из лаборатории Шмидта-Отта представим протокол.
Начните с помещения почки на холодную рассекающую пластину и используйте острый скальпель или лезвие бритвы, чтобы получить средний срез от одного до двух миллиметров. Убедитесь, что кусок ткани содержит всю кортикомедуллярную ось. Используйте микродиссекционные ножницы и щипцы, чтобы аккуратно обрезать кору по бокам центральной части.
Внутри рассеченного куска ткани должны быть хорошо видны три сегмента коры, наружный продолговатый мозг и внутренний продолговатый мозг. Перенесите кусочек почки в заранее приготовленный раствор для стабилизации РНК и инкубируйте в течение 24 часов при четырех градусах Цельсия, чтобы избежать деградации РНК. Через 24 часа удалите стабилизирующий раствор РНК.
Аккуратно удалите излишки раствора папиросной бумагой и храните салфетку при температуре минус 80 градусов Цельсия до дальнейшего использования. Возьмите замороженный кусочек почки и переложите его в 60-миллиметровую предварительно охлажденную полистирольную чашку Петри на льду, содержащую один миллилитр буфера лизиса ядер 1 или NLB1. Тщательно измельчите салфетки с помощью бритвенного лезвия или скальпеля.
Отрежьте наконечник наконечника пипетки объемом один миллилитр и переложите измельченную ткань и буфер в трубку кофемолки, помещенную на лед. Убедившись, что все кусочки были перенесены, вымойте чашку Петри пять-10 раз буфером. Медленно переместите пестик А 25 раз вверх и вниз в трубке кофемолки на льду, чтобы гомогенизировать суспензию.
Пропустите гомогенат через 100-микрометровый сетчатый фильтр в предварительно охлажденной 15-миллилитровой сборной трубке на льду и промойте фильтр еще одним миллилитром NLB1. Промойте трубку измельчителя холодным буфером для лизиса ядер EZ и выбросьте буфер. Перенесите гомогенат обратно в трубку кофемолки и медленно переместите пестик B 15 раз вверх и вниз по трубке кофемолки по льду, чтобы гомогенизировать суспензию.
Переложите гомогенат в предварительно охлажденную 15-миллилитровую сборную пробирку на льду. Промойте трубку кофемолки еще двумя миллилитрами NLB1 и обязательно перенесите все фрагменты ткани в пробирку для сбора. Инкубируйте гомогенат в течение пяти минут на льду, чтобы лизировать клетки.
Пропустите гомогенат через 40-микрометровый сетчатый фильтр в предварительно охлажденную 15-миллилитровую сборную трубку. Вращайте сборную трубку в течение пяти минут при температуре 500 раз G при четырех градусах Цельсия в центрифуге с ротором с качающимся ковшом. Тем временем добавьте раствор ингибитора РНКазы в NLB2.
Удалите надосадочную жидкость, не нарушая гранулы. Осторожно ресуспендируйте гранулы в четырех миллилитрах NLB2. Тщательно подложите суспензию одномиллилитровой подушкой из буфера градиента сахарозы.
Вращайте суспензию при 500 перегрузках в течение пяти минут при четырех градусах Цельсия в центрифуге с ротором качающегося ковша. Тем временем добавьте раствор ингибитора РНКазы в буфер суспензии ядер. После центрифугирования осторожно извлеките сборную трубку из центрифуги, стараясь не повредить два слоя при работе с сборной пробиркой.
Клеточный мусор можно наблюдать между двумя слоями. Удаляйте надосадочную жидкость аккуратно, начиная с мусора. Удалите остатки надосадочной жидкости, не нарушая гранулу ядер, и осторожно ресуспендируйте гранулу в одном миллилитре буфера суспензии ядер.
Пропустите гомогенат через 20-микрометровый сетчатый фильтр в предварительно охлажденную пятимиллилитровую пробирку для сортировки клеток, активируемую флуоресценцией. Количество генов было построено в зависимости от количества транскриптов, определенных уникальными молекулярными идентификаторами и окрашенных фракцией митохондриальных считываний, чтобы оценить качество выделенных ядер. В общей сложности 20 000 генов были обнаружены в 6 000 ядер с 1 600 медианными генами и 2 800 медианными уникальными молекулярными идентификаторами на ядро.
Паттерны экспрессии генов маркеров, обогащенных кластерами, визуализировались с помощью точечного графика, а кластеры клеточного типа — на графике встраивания стохастических соседей с Т-распределением. Процент каждого типа клеток был рассчитан и использован для определения отношения проксимальных канальцев к толстым восходящим клеткам конечностей. Крайне важно постоянно работать при четырех градусах Цельсия и определять оптимальное количество ткани в пробных прогонах, чтобы обеспечить высокое качество суспензий и оптимальные концентрации.
