Yöntemimiz, karmaşık dokulardan gen ekspresyon verilerinin tek hücre düzeyinde üretilmesine ve anlaşılmasına yardımcı olur. Yöntemimiz temel olarak herhangi bir dokuya aynı şekilde uygulanabilir ve protokolle ilgili çok az eserle yüksek kaliteli verilere yol açar. Schmidt-Ott laboratuvarından Dr. Janna Leiz ve ben protokolü sunacağız.
Böbreği soğuk bir diseksiyon plakasına yerleştirerek başlayın ve bir ila iki milimetrelik bir orta dilim elde etmek için keskin bir neşter veya tıraş bıçağı kullanın. Doku parçasının tüm kortikomedüller ekseni içerdiğinden emin olun. Korteksi orta parçanın yanlarından dikkatlice kesmek için mikrodiseksiyon makası ve forseps kullanın.
Diseke edilmiş doku parçası içinde, üç segmentli korteks, dış medulla ve iç medulla açıkça görülebilmelidir. Böbrek parçasını önceden hazırlanmış RNA stabilizasyon çözeltisine aktarın ve RNA bozulmasını önlemek için dört santigrat derecede 24 saat boyunca inkübe edin. 24 saat sonra, RNA stabilizasyon çözeltisini çıkarın.
Fazla çözeltiyi bir mendil kağıdı ile dikkatlice çıkarın ve daha fazla kullanıma kadar dokuyu eksi 80 santigrat derecede saklayın. Dondurulmuş böbrek parçasını alın ve bir mililitre Nuclei Lysis Buffer 1 veya NLB1 içeren buz üzerinde 60 milimetre, önceden soğutulmuş polistiren Petri kabına aktarın. Bir tıraş bıçağı veya neşter kullanarak dokuları iyice kesin.
Bir mililitrelik pipet ucunun ucunu kesin ve kıyılmış dokuyu ve tamponu buz üzerine yerleştirilen öğütücü tüpe aktarın. Tüm parçaların aktarıldığından emin olarak, Petri kabını tamponla beş ila 10 kez yıkayın. Süspansiyonu homojenize etmek için havane A'yı buz üzerindeki öğütücü tüpünde 25 kez yukarı ve aşağı doğru yavaşça hareket ettirin.
Homojenatı buz üzerinde önceden soğutulmuş 15 mililitrelik bir toplama tüpünde 100 mikrometrelik bir süzgeçten geçirin ve filtreyi başka bir mililitre NLB1 ile yıkayın. Öğütücü tüpünü soğuk EZ çekirdek lizis tamponu ile yıkayın ve tamponu atın. Homojenatı öğütücü tüpüne geri aktarın ve süspansiyonu homojenize etmek için B havanesini buz üzerindeki öğütücü tüpünde 15 kez yavaşça yukarı ve aşağı hareket ettirin.
Homojenatı buz üzerinde önceden soğutulmuş 15 mililitrelik bir toplama tüpüne aktarın. Öğütücü tüpünü iki mililitre NLB1 ile yıkayın ve tüm doku parçalarını toplama tüpüne aktardığınızdan emin olun. Hücreleri lize etmek için homojenatı buz üzerinde beş dakika boyunca inkübe edin.
Homojenatı 40 mikrometrelik bir süzgeçten önceden soğutulmuş 15 mililitrelik bir toplama tüpüne geçirin. Toplama tüpünü, sallanan kova rotorlu bir santrifüjde dört santigrat derecede 500 kez G'de beş dakika boyunca döndürün. Bu arada, NLB2'ye RNaz inhibitörü çözeltisi ekleyin.
Pelet'i rahatsız etmeden süpernatantı çıkarın. Peleti dört mililitre NLB2 içinde dikkatlice yeniden askıya alın. Süspansiyonun altını bir mililitrelik sakkaroz gradyan tamponu yastığı ile dikkatlice yerleştirin.
Süspansiyonu 500 kez G'de dört santigrat derecede beş dakika boyunca sallanan kova rotorlu bir santrifüjde döndürün. Bu arada, çekirdek süspansiyon tamponuna RNaz inhibitörü çözeltisi ekleyin. Santrifüjlemeden sonra, toplama tüpünü tutarken iki katmanı rahatsız etmemeye dikkat ederek toplama tüpünü santrifüjden yavaşça çıkarın.
Hücre kalıntıları iki katman arasında gözlemlenebilir. Enkazdan başlayarak süpernatantı dikkatlice çıkarın. Çekirdek peletini bozmadan kalan süpernatantı çıkarın ve peleti bir mililitre çekirdek süspansiyon tamponunda dikkatlice yeniden askıya alın.
Homojenatı 20 mikrometrelik bir süzgeçten önceden soğutulmuş, beş mililitrelik floresanla aktive edilmiş hücre ayıklama toplama tüpüne geçirin. Genlerin sayısı, benzersiz moleküler tanımlayıcılar tarafından tanımlanan transkriptlerin sayısına karşı çizildi ve izole edilen çekirdeklerin kalitesini değerlendirmek için mitokondriyal okumaların fraksiyonu ile renklendirildi. 6.000 çekirdekte 1.600 medyan gen ve çekirdek başına 2.800 medyan benzersiz moleküler tanımlayıcı ile toplam 20.000 gen tespit edildi.
Küme ile zenginleştirilmiş belirteçlerin gen ekspresyon kalıpları, bir nokta grafiği kullanılarak görselleştirildi ve t-dağıtılmış stokastik komşu gömme grafiğindeki hücre tipi kümeleri görselleştirildi. Her hücre tipinin yüzdesi hesaplandı ve proksimal tübülün kalın yükselen ekstremite hücrelerine oranını belirlemek için kullanıldı. Her zaman dört santigrat derecede çalışmak ve yüksek kaliteli süspansiyonlar ve optimum konsantrasyonlar sağlamak için deneme çalışmalarında en uygun doku miktarını belirlemek çok önemlidir.
