Nosso método ajuda a gerar e entender dados de expressão gênica de tecidos complexos em um nível de célula única. Nosso método pode ser aplicado a basicamente qualquer tecido da mesma maneira e leva a dados de alta qualidade com muito poucos artefatos relacionados ao protocolo. A Dra. Janna Leiz e eu, do laboratório Schmidt-Ott, apresentaremos o protocolo.
Comece colocando o rim em uma placa de dissecação fria e use um bisturi afiado ou lâmina de barbear para obter uma fatia média de um a dois milímetros. Certifique-se de que a peça de tecido contém todo o eixo corticomedular. Use tesouras e pinças de microdissecação para aparar cuidadosamente o córtex dos lados da peça central.
Dentro da peça de tecido dissecada, os três segmentos córtex, medula externa e medula interna devem ser claramente visíveis. Transfira a peça renal para a solução de estabilização de RNA previamente preparada e incube por 24 horas a quatro graus Celsius para evitar a degradação do RNA. Após 24 horas, remova a solução de estabilização de RNA.
Retire cuidadosamente o excesso de solução com um papel de seda e guarde o tecido a menos 80 graus Celsius até uma nova utilização. Pegue a peça de rim congelada e transfira-a para uma placa de Petri de poliestireno pré-resfriada de 60 milímetros no gelo contendo um mililitro de Nuclei Lysis Buffer 1, ou NLB1. Pice os tecidos completamente usando uma lâmina de barbear ou bisturi.
Corte a ponta de uma ponta de pipeta de um mililitro e transfira o tecido picado e o tampão para o tubo do moedor colocado no gelo. Certificando-se de que todas as peças foram transferidas, lave a placa de Petri cinco a 10 vezes com o tampão. Mova lentamente o pilão A 25 vezes para cima e para baixo no tubo do moedor no gelo para homogeneizar a suspensão.
Passe o homogeneizado através de um filtro de 100 micrômetros em um tubo de coleta pré-resfriado de 15 mililitros no gelo e lave o filtro com outro mililitro de NLB1. Lave o tubo do moedor com o tampão de lise de núcleos EZ frio e descarte o tampão. Transfira o homogeneizado de volta para o tubo do moedor e mova lentamente o pilão B 15 vezes para cima e para baixo no tubo do moedor no gelo para homogeneizar a suspensão.
Transfira o homogeneizado para um tubo de coleta pré-resfriado de 15 mililitros no gelo. Lave o tubo do moedor com mais dois mililitros de NLB1 e certifique-se de transferir todos os fragmentos de tecido para o tubo de coleta. Incubar o homogeneizado por cinco minutos no gelo para lisar as células.
Passe o homogeneizado através de um filtro de 40 micrômetros em um tubo de coleta de 15 mililitros pré-resfriado. Gire o tubo de coleta por cinco minutos a 500 vezes G a quatro graus Celsius em uma centrífuga com um rotor de balde oscilante. Entretanto, adicione a solução inibidora da RNase ao NLB2.
Remova o sobrenadante sem perturbar o pellet. Ressuspeite cuidadosamente o pellet em quatro mililitros de NLB2. Cuidadosamente subposição na suspensão com uma almofada de um mililitro de tampão gradiente de sacarose.
Gire a suspensão a 500 vezes G por cinco minutos a quatro graus Celsius em uma centrífuga com um rotor de balde oscilante. Enquanto isso, adicione a solução inibidora da RNase ao tampão de suspensão dos núcleos. Após a centrifugação, remova suavemente o tubo de coleta da centrífuga, tomando cuidado para não perturbar as duas camadas ao manusear o tubo de coleta.
Os detritos celulares podem ser observados entre as duas camadas. Remova o sobrenadante com cuidado, começando com os detritos. Remova o sobrenadante restante sem perturbar o pellet de núcleos e ressuspenda cuidadosamente o pellet em um mililitro de buffer de suspensão de núcleos.
Passe o homogeneizado através de um filtro de 20 micrômetros para o tubo de coleta de coleta de classificação celular ativado por fluorescência de cinco mililitros pré-resfriado. O número de genes foi plotado contra o número de transcritos definidos por identificadores moleculares únicos e coloridos pela fração de leituras mitocondriais para avaliar a qualidade dos núcleos isolados. Um total de 20.000 genes foram detectados em 6.000 núcleos com 1.600 genes medianos e 2.800 identificadores moleculares únicos medianos por núcleo.
Os padrões de expressão gênica de marcadores enriquecidos com clusters foram visualizados usando um gráfico de pontos e agrupamentos de tipo celular em um gráfico de incorporação de vizinhos estocásticos distribuídos em t. A porcentagem de cada tipo de célula foi calculada e utilizada para determinar a razão entre o túbulo proximal e as células espessas dos membros ascendentes. É fundamental trabalhar a quatro graus Celsius em todos os momentos e determinar a quantidade ideal de tecido em ensaios para garantir suspensões de alta qualidade e concentrações ideais.
