השיטה שלנו מסייעת ליצור ולהבין נתוני ביטוי גנים מרקמות מורכבות ברמת התא הבודד. השיטה שלנו יכולה להיות מיושמת על כל רקמה באותו אופן ומובילה לנתונים באיכות גבוהה עם מעט מאוד ממצאים הקשורים לפרוטוקול. ד"ר יאנה ליז ואני ממעבדת שמידט-אוט נציג את הפרוטוקול.
התחל על ידי הנחת הכליה על צלחת ניתוח קר ולהשתמש אזמל חד או סכין גילוח כדי לקבל פרוסה אמצעית של אחד עד שני מילימטרים. ודא שפיסת הרקמה מכילה את כל ציר הקורטיקומדולארי. השתמש במספריים ומלקחיים מיקרודיסקציה כדי לחתוך בזהירות את קליפת המוח מצידי החלק המרכזי.
בתוך פיסת הרקמה המנותחת, שלושת המקטעים קליפת המוח, המדולה החיצונית והמדולה הפנימית צריכים להיות גלויים בבירור. מעבירים את פיסת הכליה לתמיסת ייצוב RNA שהוכנה מראש ודגרים במשך 24 שעות בארבע מעלות צלזיוס כדי למנוע התפרקות RNA. לאחר 24 שעות, הסר את תמיסת ייצוב ה- RNA.
בזהירות להסיר את התמיסה העודפת עם נייר טישו ולאחסן את הרקמה על מינוס 80 מעלות צלזיוס עד לשימוש נוסף. קחו את פיסת הכליה הקפואה והעבירו אותה לצלחת פטרי פוליסטירן מקוררת מראש בקוטר 60 מ"מ על קרח המכילה מיליליטר אחד של Nuclei Lysis Buffer 1, או NLB1. טחון את הרקמות ביסודיות באמצעות סכין גילוח או אזמל.
חותכים את קצה קצה פיפטה של מיליליטר אחד ומעבירים את הרקמה הטחונה ואת החיץ לצינור המטחנה המונח על קרח. כדי לוודא שכל החתיכות הועברו, שטפו את צלחת הפטרי חמש עד 10 פעמים עם החיץ. הזיזו באיטיות את המזיק A 25 פעמים למעלה ולמטה בצינור המטחנה על קרח כדי ליצור הומוגניות של המתלים.
מעבירים את ההומוגנט דרך מסננת של 100 מיקרומטר בצינור איסוף מקורר מראש של 15 מיליליטר על קרח ושוטפים את המסנן עם מיליליטר אחד נוסף של NLB1. שטפו את צינור המטחנה במאגר גרעיני EZ קרים והשליכו את החיץ. מעבירים את ההומוגנט בחזרה לצינור המטחנה ומזיזים באיטיות את המזיק B 15 פעמים למעלה ולמטה בצינור המטחנה על קרח כדי ליצור הומוגניות של המתלים.
מעבירים את ההומוגנט לצינור איסוף מקורר מראש של 15 מיליליטר על קרח. שטפו את צינור המטחנה עם עוד שני מיליליטר של NLB1, והקפידו להעביר את כל שברי הרקמה לצינור האיסוף. לדגור על הומוגנט במשך חמש דקות על קרח כדי לשכב את התאים.
מעבירים את ההומוגנט דרך מסננת של 40 מיקרומטר לתוך צינור איסוף מקורר מראש של 15 מיליליטר. סובבו את צינור האיסוף במשך חמש דקות במהירות של 500 פעמים G בארבע מעלות צלזיוס בצנטריפוגה עם רוטור דלי מתנדנד. בינתיים, הוסף פתרון מעכב RNase ל- NLB2.
מוציאים את הסופרנאטנט מבלי להפריע לכדור. בזהירות להשעות את הגלולה בארבעה מיליליטר של NLB2. הניחו בזהירות את המתלה עם כרית של מיליליטר אחד של חיץ הדרגתי סוכרוז.
סובבו את המתלה ב-500 כפול G במשך חמש דקות בארבע מעלות צלזיוס בצנטריפוגה עם רוטור דלי מתנדנד. בינתיים, הוסף פתרון מעכב RNase למאגר ההשעיה של הגרעינים. לאחר הצנטריפוגה, הסר בעדינות את צינור האיסוף מהצנטריפוגה, תוך זהירות שלא להפריע לשתי השכבות בעת הטיפול בצינור האיסוף.
ניתן לצפות בפסולת התא בין שתי השכבות. מוציאים את הסופרנאטנט בזהירות, מתחילים עם הפסולת. הסר את הסופרנאטנט שנותר מבלי להפריע לכדורית הגרעינים והשהה בזהירות את הגלולה במיליליטר אחד של חיץ תרחיף גרעינים.
העבירו את ההומוגנט דרך מסננת של 20 מיקרומטר לתוך צינור איסוף התאים המקורר מראש, חמישה מיליליטר המופעל על ידי פלואורסצנטיות. מספר הגנים שורטט כנגד מספר התעתיקים שהוגדרו על ידי מזהים מולקולריים ייחודיים ונצבעו על ידי חלק הקריאות המיטוכונדריאליות כדי להעריך את איכות הגרעינים המבודדים. סך של 20, 000 גנים זוהו 6, 000 גרעינים עם 1, 600 גנים חציון ו 2, 800 מזהים מולקולריים ייחודיים חציון לכל גרעין.
דפוסי ביטוי גנים של סמנים מועשרים בצביר הודגמו באמצעות תרשים נקודה, וצבירי סוגי תאים בתרשים שיבוץ שכן סטוכסטי מבוזר T. האחוז של כל סוג תא חושב ושימש לקביעת היחס בין צינורית פרוקסימלית לתאי גפיים עולים עבים. זה קריטי לעבוד בארבע מעלות צלזיוס בכל עת ולקבוע את כמות הרקמה האופטימלית בריצות ניסוי כדי להבטיח מתלים באיכות גבוהה וריכוזים אופטימליים.
