Nosso protocolo permite que os pesquisadores analisem o processo de arteriogênese in vivo, rastreando a aderência e o extravasamento de células imunes em artérias colaterais em crescimento em tempo real. A técnica de microscopia multifóton permite a visualização da dinâmica celular no tecido profundo de modelos vivos de camundongos com baixa fototoxicidade e alta resolução espaço-temporal. O procedimento microscópico será demonstrado por Dominic van den Heuvel, assistente técnico da plataforma de imagem multifóton do laboratório da Dra. Helen Ishikawa-Ankerhold.
Vou demonstrar o procedimento cirúrgico. Para começar, coloque o rato anestesiado na posição supina. Em seguida, coloque dois pedaços de argila moldada sob o membro posterior superior do mouse para garantir uma posição plana do músculo adutor.
Coloque o mouse sob o microscópio estéreo. Após a retirada dos pelos de ambas as pernas, desinfetar e cortar a pele em círculo ao redor da cicatriz da ligadura anterior da artéria femoral do membro posterior direito. Remova a pele e a camada de gordura do topo da perna e afaste a pele restante usando suturas para criar uma bolsa ao redor do músculo adutor com os vasos colaterais.
Em seguida, remova a gordura subcutânea para obter uma visão clara do músculo adutor, da artéria e veia profundas, bem como dos vasos colaterais. Remova a camada muscular superficial no topo dos vasos colaterais usando pinças finas. Encha a bolsa preparada com soro fisiológico para evitar que o tecido seque e continue o mesmo procedimento para o membro posterior esquerdo operado simuladamente.
Antes da aquisição de imagens, adicione gel ultrassônico em ambas as bolsas, o que evita a secagem e serve como um meio de imersão para acoplamento óptico com a objetiva. Ligue a chave da caixa de laser de safira de titânio, a caixa de interfaces eletrônicas, a unidade de aquecimento da câmara da incubadora, a lâmpada fluorescente e o computador. Inicie o software de aquisição.
Ajuste o comprimento de onda para 800 nanômetros e abra o obturador do microscópio. Na caixa de diálogo do assistente de medição, escolha o modo de instrumento como feixe único e o modo de medição como timelapse de varredura 3D. Em seguida, transfira o camundongo anestesiado para a câmara de incubação pré-aquecida do microscópio e posicione a área com o gel ultrassônico diretamente em contato com a lente frontal objetiva.
Abra o obturador do microscópio de epifluorescência. Em seguida, escolha um filtro adequado ou uma configuração dicroica para visualização do FTSE. Defina a área de interesse seguindo o fluxo sanguíneo sob iluminação de epifluorescência.
Depois de trazer a área de interesse para o campo de visão central, feche o obturador do microscópio de epifluorescência. Na caixa de diálogo do scanner XY, defina os parâmetros necessários para tamanho da imagem, pixel, frequência, média de linha. Ajuste a potência do laser e defina o ganho do multiplicador de fotos para os canais verde, vermelho e azul.
Selecione um objetivo adequado para imagens intravitais e ajustes de correção de deriva. Defina o intervalo de pilha de imagens iniciando o modo de aquisição de visualização pressionando o botão vermelho na janela de diálogo do assistente de medição. Para obter boas imagens, defina a área e a estrutura de interesse focalizando.
Ao observar a tela, mude o foco movendo o objetivo até que a imagem desapareça e defina-o como zero. Defina a posição objetiva como a última posição na direção axial. Em seguida, mude o foco na direção oposta, movendo o objetivo para baixo até que a imagem desapareça da tela novamente.
Clique no botão Parar no canto superior esquerdo da caixa de diálogo do assistente de medição e defina o tamanho da etapa para dois micrômetros. Escolha o eixo python como o primeiro dispositivo de eixo na caixa de diálogo do assistente de medição e selecione não ativar o modo de salvamento automático. Em seguida, marque a caixa de salvamento automático somente no eixo de tempo.
Em seguida, pressione o ícone Python na janela de dispositivos disponíveis para abrir a janela de diálogo Python. Nas configurações do eixo de diálogo do Python, insira as seções de e para e insira o número de etapas. Vá para a janela de diálogo Z do estágio XYZ e amplie o intervalo de varredura em 200 micrômetros em ambas as extremidades.
Para fazer isso, digite 200 micrômetros no início e insira menos 240 micrômetros no final e o alcance será automaticamente definido como menos 440 micrômetros. Abra a caixa de diálogo front-end do VivoStake. Inicie a aquisição de imagens pressionando a ponta de seta verde no canto superior esquerdo da caixa de diálogo do assistente de medição.
Se a correção de desvio ao vivo for usada, procure uma caixa de diálogo para que a configuração de correção de desvio apareça. Em seguida, defina o canal de aquisição usado como em uma referência de ponto de referência móvel. Insira o deslocamento de correção máxima em micrômetros adicionados à primeira e à última posições Z e clique em OK. Monitore o deslocamento de deriva de corrente em X, Y e Z em tempo real durante a aquisição da imagem na janela de diálogo front-end do fluxo vivo e interrompa a aquisição da imagem após 35 minutos, quando outro ciclo de reinjeção de anestesia for necessário.
Injetar meia dose da mistura de MMF e reiniciar a aquisição de imagens até que o experimento seja concluído. Esta ferramenta permite a aquisição de imagens a longo prazo, permite a coleta de dados de alta qualidade e é adequada para rastrear as células para medições de velocidade. Como mostrado sem correção de deriva, a região de interesse se afasta progressivamente da visão de registro, afetando a capacidade de rastrear células para análise de velocidade.
No entanto, filmes estáveis podem ser gravados com o software de correção de deriva e mais células podem ser rastreadas por um longo período. O software de correção de deriva também pode fornecer uma visualização dos deslocamentos X, Y e Z ao longo do tempo que foi corrigido pelo sistema. A microscopia multifóton oferece uma alta resolução espaço-temporal para o rastreamento de leucócitos, em que as etapas e a velocidade da migração celular podem ser rastreadas e monitoradas.
Ao preparar os vasos colaterais para imagens multifótons, é essencial evitar danos às artérias colaterais. Antes de realizar exames de imagem, é importante identificar com segurança a artéria colateral correta. Com este novo procedimento de imagem intravital de múltiplos fótons das artérias colaterais, é possível analisar a aderência e o extravasamento de todas as células sanguíneas in vivo através da mudança do rótulo de anticorpos.
