私たちのプロトコルにより、研究者は、成長する側副動脈における免疫細胞の接着と血管外漏出をリアルタイムで追跡することにより、in vivoでの動脈形成のプロセスを分析できます。多光子顕微鏡技術は、生きているマウスモデルの深部組織における細胞動態を、光毒性が低く、高い時空間分解能で可視化することを可能にします。顕微鏡の手順は、ヘレン・イシカワ・アンカーホールド博士の研究室の多光子イメージングプラットフォームの技術アシスタントであるドミニク・ファン・デン・ヒューベルによって実証されます。
手術手順を実演します。まず、麻酔をかけたマウスを仰臥位に置きます。次に、マウスの上後肢の下に2枚の成形粘土を置き、内転筋の平面位置を確保します。
マウスを実体顕微鏡の下に置きます。両足から毛を取り除いた後、消毒し、右後肢の以前の大腿動脈結紮の瘢痕の周りの円で皮膚を切ります。脚の上部から皮膚と脂肪層を取り除き、縫合糸を使用して残りの皮膚を脇に引っ張り、側副血管で内転筋の周りにポケットを作成します。
次に、皮下脂肪を取り除き、内転筋、深部動脈、静脈、側副血管の鮮明なビジョンを取得します。細かい鉗子を使用して側副血管の上にある表在筋層を取り除きます。組織が乾燥するのを防ぐために準備したポケットに生理食塩水を入れ、偽手術の左後肢についても同じ手順を続けます。
イメージングの前に、両方のポケットに超音波ゲルを追加して、乾燥を防ぎ、対物レンズとの光結合のための浸漬媒体として機能します。チタンサファイアレーザーボックス、電子インターフェースボックス、インキュベーターチャンバーの加熱ユニット、蛍光灯、およびコンピューターのキーをオンにします。取得ソフトウェアを起動します。
波長を800ナノメートルに設定し、顕微鏡シャッターを開きます。測定ウィザードダイアログで、計器モードをシングルビーム、測定モードを3Dスキャンタイムラプスとして選択します。次に、麻酔をかけたマウスを顕微鏡の予め温めたインキュベーションチャンバーに移し、超音波ゲルのある領域を対物レンズのフロントレンズに直接接触させます。
落射蛍光顕微鏡のシャッターを開きます。次に、FTSEの視覚化に適したフィルターまたはダイクロイック設定を選択します。落射蛍光照明下で血流を追跡することにより、関心領域を定義します。
対象領域を中央視野に入れたら、落射蛍光顕微鏡シャッターを閉じます。XYスキャナーダイアログで、画像サイズ、ピクセル、周波数、ライン平均に必要なパラメーターを設定します。レーザー出力を調整し、チャンネルの緑、赤、青の写真乗数ゲインを設定します。
生体内イメージングとドリフト補正の設定に適した対物レンズを選択します。測定ウィザードダイアログウィンドウの赤いボタンを押してプレビュー取得モードを開始し、画像スタック範囲を定義します。良好な画像を得るには、焦点を合わせることによって関心のある領域と構造を定義します。
画面を観察しながら、画像が消えるまで対物レンズを動かしてフォーカスを変更し、ゼロに設定します。目標位置を軸方向の最後の位置として設定します。次に、画像が画面から再び消えるまで対物レンズを下に動かして、反対方向にフォーカスを変更します。
測定ウィザードダイアログの左上隅にある停止ボタンをクリックし、ステップサイズを2マイクロメートルに設定します。測定ウィザードダイアログで最初の軸デバイスとしてPython軸を選択し、自動保存モードをアクティブにしないを選択します。次に、時間軸でのみ自動保存チェックボックスをオンにします。
次に、使用可能なデバイスウィンドウのPythonアイコンを押して、Pythonダイアログウィンドウを開きます。Python ダイアログの軸設定で、開始セクションと終了セクションを入力し、ステップ数を入力します。XYZステージZダイアログウィンドウに移動し、スキャン範囲を両端で200マイクロメートル拡大します。
これを行うには、開始に200マイクロメートルを入力し、最後にマイナス240マイクロメートルを入力すると、範囲は自動的にマイナス440マイクロメートルに設定されます。VivoFollow フロントエンドダイアログを開きます。測定ウィザードダイアログの左上隅にある緑色の矢印を押して、画像取得を開始します。
ライブドリフト補正が使用されている場合は、表示されるドリフト補正設定のダイアログを探します。次に、モバイルランドマーク参照で使用される取得チャネルを設定します。最初と最後のZ位置に追加された最大補正オフセットをマイクロメートル単位で入力し、「OK」をクリックします。生体内フローフロントエンドダイアログウィンドウでの画像取得中にX、Y、Zの電流ドリフトオフセットをリアルタイムで監視し、麻酔の再注入の別のサイクルが必要な場合は35分後に画像取得を停止します。
MMFミックスの半分の用量を注入し、実験が終了するまで画像取得を再開します。このツールは、長期間の画像取得を可能にし、高品質のデータ収集を可能にし、速度測定のための細胞の追跡に適しています。ドリフト補正なしで示されているように、関心領域は記録ビューから徐々に離れ、速度分析のために細胞を追跡する機能に影響を与えます。
しかし、ドリフト補正ソフトで安定した動画を撮影でき、より多くの細胞を長期間追跡することができます。ドリフト補正ソフトウェアは、システム補正された時間の経過に伴うX、Y、およびZオフセットの視覚化を提供することもできます。多光子顕微鏡は、白血球追跡のための高い時空間分解能を提供し、細胞移動ステップと速度を追跡および監視することができます。
多光子イメージングのために側副血管を準備することにより、側副動脈への損傷を回避することが不可欠です。イメージングの前に、正しい側副動脈を安全に特定することが重要です。側副動脈の生体内多光子イメージングのこの新しい手順により、抗体標識を変更することにより、in vivo内のすべての血球の接着と血管外漏出を分析することができます。
