우리의 프로토콜을 통해 연구자들은 성장하는 측부 동맥에서 면역 세포 부착 및 혈관외 유출을 실시간으로 추적하여 생체 내 동맥 형성 과정을 분석할 수 있습니다. 다광자 현미경 기술을 사용하면 광독성이 낮고 시공간 해상도가 높은 살아있는 마우스 모델의 심부 조직에서 세포 역학을 시각화할 수 있습니다. 현미경 절차는 Helen Ishikawa-Ankerhold 박사 실험실의 다광자 이미징 플랫폼의 기술 조교인 Dominic van den Heuvel이 시연합니다.
수술 과정을 시연하겠습니다. 시작하려면 마취 된 마우스를 앙와위 자세로 놓습니다. 그런 다음 내전근의 평면 위치를 보장하기 위해 마우스의 상부 뒷다리 아래에 두 개의 성형 점토 조각을 놓습니다.
마우스를 실체 현미경 아래에 놓습니다. 양쪽 다리에서 털을 제거한 후 오른쪽 뒷다리의 초기 대퇴 동맥 결찰의 흉터 주위에 원을 그리며 피부를 소독하고 자릅니다. 다리 상단에서 피부와 지방층을 제거하고 봉합사를 사용하여 나머지 피부를 옆으로 당겨 측부 혈관으로 내전근 주위에 주머니를 만듭니다.
다음으로, 피하 지방을 제거하여 내전근, 프로 툰다 동맥 및 정맥, 측부 혈관의 명확한 시야를 확보하십시오. 미세한 집게를 사용하여 측부 혈관 상단의 표면 근육층을 제거합니다. 조직이 건조되는 것을 방지하기 위해 준비된 주머니에 식염수를 채우고 가짜 수술 왼쪽 뒷다리에 대해 동일한 절차를 계속하십시오.
이미징하기 전에 두 주머니에 초음파 젤을 추가하여 건조를 방지하고 대물렌즈와의 광학 결합을 위한 침지 매체 역할을 합니다. 티타늄 사파이어 레이저 상자, 전자 인터페이스 상자, 인큐베이터 챔버의 가열 장치, 형광등 및 컴퓨터의 키를 켭니다. 획득 소프트웨어를 실행합니다.
파장을 800나노미터로 설정하고 현미경 셔터를 엽니다. 측정 마법사 대화 상자에서 기기 모드를 단일 빔으로, 측정 모드를 3D 스캔 타임랩스로 선택합니다. 그런 다음 마취된 마우스를 현미경의 예열된 배양 챔버로 옮기고 초음파 젤이 대물 렌즈와 직접 접촉하는 영역을 배치합니다.
에피형광 현미경 셔터를 엽니다. 그런 다음 FTSE 시각화를 위한 적절한 필터 또는 이색성 설정을 선택합니다. epifluorescence 조명 하에서 혈류를 추적하여 관심 영역을 정의합니다.
관심 영역을 중앙 시야로 가져온 후 epifluorescence 현미경 셔터를 닫습니다. XY 스캐너 대화 상자에서 이미지 크기, 픽셀, 빈도, 라인 평균에 필요한 매개 변수를 설정합니다. 레이저 출력을 조정하고 채널 녹색, 빨간색 및 파란색에 대한 사진 배율 게인을 설정합니다.
생체 내 이미징 및 드리프트 보정 설정을 위한 적절한 대물렌즈를 선택합니다. 측정 마법사 대화 상자 창에서 빨간색 버튼을 눌러 미리보기 수집 모드를 시작하여 이미지 스택 범위를 정의합니다. 좋은 이미지를 얻으려면 초점을 맞춰 관심 영역과 구조를 정의하십시오.
화면을 관찰하면서 이미지가 사라질 때까지 대물렌즈를 움직여 초점을 변경하고 0으로 설정합니다. 목표 위치를 축 방향의 마지막 위치로 설정합니다. 그런 다음 이미지가 화면에서 다시 사라질 때까지 대물렌즈를 아래로 이동하여 반대 방향으로 초점을 변경합니다.
측정 마법사 대화 상자의 왼쪽 상단 모서리에 있는 중지 버튼을 클릭하고 스텝 크기를 2마이크로미터로 설정합니다. 측정 마법사 대화 상자에서 python 축을 첫 번째 축 장치로 선택하고 자동 저장 모드를 활성화하지 않음을 선택합니다. 그런 다음 시간 축에서만 자동 저장 상자를 선택합니다.
그런 다음 사용 가능한 장치 창에서 Python 아이콘을 눌러 Python 대화 상자 창을 엽니다. Python 대화 상자 축 설정에서 from 및 to 섹션을 입력한 다음 단계 수를 입력합니다. XYZ 스테이지 Z 대화상자 창으로 이동하여 양쪽 끝에서 스캔 범위를 200마이크로미터로 확대합니다.
이렇게 하려면 시작 부분에 200마이크로미터를 입력하고 끝에 마이너스 240마이크로미터를 입력하면 범위가 자동으로 마이너스 440마이크로미터로 설정됩니다. VivoFollow 프런트 엔드 대화 상자를 엽니다. 측정 마법사 대화 상자의 왼쪽 상단 모서리에 있는 녹색 화살표를 눌러 이미지 수집을 시작합니다.
실시간 드리프트 보정을 사용하는 경우 드리프트 보정 구성이 표시되도록 대화상자를 찾습니다. 그런 다음 모바일 랜드마크 참조에서와 같이 사용되는 획득 채널을 설정합니다. 첫 번째 및 마지막 Z 위치에 추가된 최대 보정 오프셋(마이크로미터)을 입력하고 [확인]을 클릭합니다. 생체 흐름 프런트 엔드 대화 창에서 이미지 획득 중에 X, Y 및 Z의 현재 드리프트 오프셋을 실시간으로 모니터링하고 또 다른 마취 재주입 주기가 필요한 경우 35분 후에 이미징 획득을 중지합니다.
MMF 믹스의 절반 용량을 주입하고 실험이 끝날 때까지 이미징 획득을 다시 시작합니다. 이 도구는 장기적인 이미지 획득을 가능하게 하고 고품질 데이터 수집을 가능하게 하며 속도 측정을 위해 셀을 추적하는 데 적합합니다. 드리프트 보정 없이 표시된 것처럼 관심 영역은 기록 보기에서 점진적으로 멀어지며 속도 분석을 위해 셀을 추적하는 기능에 영향을 줍니다.
그러나 드리프트 보정 소프트웨어로 안정적인 동영상을 녹화할 수 있으며 장기간에 걸쳐 더 많은 셀을 추적할 수 있습니다. 드리프트 보정 소프트웨어는 시스템 보정된 시간 경과에 따른 X, Y 및 Z 오프셋의 시각화도 제공할 수 있습니다. 다광자 현미경은 백혈구 추적을 위한 높은 시공간 분해능을 제공하여 세포 이동 단계와 속도를 추적하고 모니터링할 수 있습니다.
다광자 이미징을 위한 측부 혈관을 준비함으로써 측부 동맥의 손상을 방지하는 것이 필수적입니다. 영상을 촬영하기 전에 올바른 측부 동맥을 안전하게 식별하는 것이 중요합니다. 측부 동맥의 생체 내 다광자 이미징의 이 새로운 절차를 통해 항체 라벨을 변경하여 생체 내 모든 혈액 세포의 부착 및 유출을 분석할 수 있습니다.
