Notre protocole permet aux chercheurs d’analyser le processus d’artériogenèse in vivo en suivant l’adhérence et l’extravasation des cellules immunitaires dans les artères collatérales en croissance en temps réel. La technique de microscopie multiphotonique permet de visualiser la dynamique cellulaire dans les tissus profonds de modèles murins vivants à faible phototoxicité et à haute résolution spatio-temporelle. La procédure au microscope sera démontrée par Dominic van den Heuvel, assistant technique de la plate-forme d’imagerie multiphotonique du laboratoire du Dr Helen Ishikawa-Ankerhold.
Je vais démontrer l’intervention chirurgicale. Pour commencer, placez la souris anesthésiée en décubitus dorsal. Placez ensuite deux morceaux d’argile moulée sous le membre postérieur supérieur de la souris pour assurer une position plane du muscle adducteur.
Placez la souris sous le stéréomicroscope. Après avoir enlevé les poils des deux jambes, désinfectez et coupez la peau en cercle autour de la cicatrice de la ligature antérieure de l’artère fémorale du membre postérieur droit. Retirez la couche de peau et de graisse du haut de la jambe et écartez la peau restante à l’aide de sutures pour créer une poche autour du muscle adducteur avec les vaisseaux collatéraux.
Ensuite, retirez la graisse sous-cutanée pour obtenir une vision claire du muscle adducteur, de l’artère et de la veine profunda, ainsi que des vaisseaux collatéraux. Enlevez la couche musculaire superficielle sur le dessus des vaisseaux collatéraux à l’aide d’une pince fine. Remplissez la poche préparée avec une solution saline pour empêcher le tissu de sécher et continuez la même procédure pour le membre postérieur gauche opéré fictif.
Avant l’imagerie, ajoutez du gel à ultrasons dans les deux poches qui empêche le séchage et sert de milieu d’immersion pour le couplage optique avec l’objectif. Allumez la clé du boîtier laser saphir en titane, le boîtier d’interfaces électroniques, l’unité de chauffage de la chambre de l’incubateur, la lampe fluorescente et l’ordinateur. Lancez le logiciel d’acquisition.
Réglez la longueur d’onde sur 800 nanomètres et ouvrez l’obturateur du microscope. Dans la boîte de dialogue de l’assistant de mesure, choisissez le mode instrument comme faisceau unique et le mode de mesure comme timelapse de numérisation 3D. Ensuite, transférez la souris anesthésiée dans la chambre d’incubation préchauffée du microscope et positionnez la zone avec le gel à ultrasons directement en contact avec la lentille frontale de l’objectif.
Ouvrez l’obturateur du microscope à épifluorescence. Choisissez ensuite un filtre ou un paramètre dichroïque adéquat pour la visualisation FTSE. Définissez la zone d’intérêt en suivant le flux sanguin sous éclairage par épifluorescence.
Après avoir placé la zone d’intérêt dans le champ de vision central, fermez l’obturateur du microscope à épifluorescence. Dans la boîte de dialogue du scanner XY, définissez les paramètres requis pour la taille de l’image, le pixel, la fréquence et la moyenne des lignes. Ajustez la puissance laser et réglez le gain du multiplicateur photo pour les canaux vert, rouge et bleu.
Sélectionnez un objectif adéquat pour les paramètres d’imagerie intravitale et de correction de la dérive. Définissez la plage de piles d’images en démarrant le mode d’acquisition de l’aperçu en appuyant sur le bouton rouge dans la boîte de dialogue de l’assistant de mesure. Pour obtenir de bonnes images, définissez la zone et la structure d’intérêt en faisant la mise au point.
Tout en observant l’écran, changez de focus en déplaçant l’objectif jusqu’à ce que l’image disparaisse et réglez-le sur zéro. Définissez la position de l’objectif comme dernière position dans la direction axiale. Ensuite, changez la mise au point dans la direction opposée en déplaçant l’objectif vers le bas jusqu’à ce que l’image disparaisse à nouveau de l’écran.
Cliquez sur le bouton d’arrêt dans le coin supérieur gauche de la boîte de dialogue de l’assistant de mesure et définissez la taille du pas sur deux micromètres. Choisissez l’axe python comme périphérique du premier axe dans la boîte de dialogue de l’assistant de mesure et sélectionnez ne pas activer le mode d’enregistrement automatique. Cochez ensuite la case d’enregistrement automatique uniquement sur l’axe temporel.
Ensuite, appuyez sur l’icône Python dans la fenêtre des périphériques disponibles pour ouvrir la boîte de dialogue Python. Dans les paramètres de l’axe de la boîte de dialogue Python, entrez les sections from et to, puis entrez le nombre d’étapes. Accédez à la fenêtre de dialogue Stade Z XYZ et agrandissez la plage de balayage de 200 micromètres aux deux extrémités.
Pour ce faire, entrez 200 micromètres au début et entrez moins 240 micromètres à la fin et la plage sera automatiquement définie sur moins 440 micromètres. Ouvrez la boîte de dialogue frontale VivoFollow. Démarrez l’acquisition d’image en appuyant sur la pointe de flèche verte dans le coin supérieur gauche de la boîte de dialogue de l’assistant de mesure.
Si la correction de dérive sous tension est utilisée, recherchez une boîte de dialogue pour la configuration de correction de dérive à afficher. Définissez ensuite le canal d’acquisition utilisé comme référence de repère mobile. Entrez le décalage de correction maximal en micromètres ajouté à la première et à la dernière position Z, puis cliquez sur OK. Surveillez le décalage de dérive de courant dans X, Y et Z en temps réel pendant l’acquisition d’image dans la fenêtre de dialogue frontale du flux vivo et arrêtez l’acquisition d’imagerie après 35 minutes lorsqu’un autre cycle de réinjection d’anesthésie est nécessaire.
Injectez une demi-dose du mélange MMF et recommencez l’acquisition de l’imagerie jusqu’à ce que l’expérience soit terminée. Cet outil permet l’acquisition d’images à long terme, permet la collecte de données de haute qualité et convient au suivi des cellules pour les mesures de vitesse. Comme indiqué sans correction de dérive, la région d’intérêt s’éloigne progressivement de la vue d’enregistrement, ce qui a un impact sur la capacité de suivi des cellules pour l’analyse de la vitesse.
Cependant, des films stables peuvent être enregistrés avec le logiciel de correction de dérive et plus de cellules peuvent être suivies sur une longue période. Le logiciel de correction de dérive peut également fournir une visualisation des décalages X, Y et Z au fil du temps qui ont été corrigés par le système. La microscopie multiphotonique offre une résolution spatio-temporelle élevée pour le suivi des leucocytes dans laquelle les étapes et la vitesse de migration cellulaire peuvent être suivies et surveillées.
En préparant les vaisseaux collatéraux pour l’imagerie multiphotonique, il est essentiel d’éviter d’endommager les artères collatérales. Avant l’imagerie, il est important d’identifier en toute sécurité la bonne artère collatérale. Avec cette nouvelle procédure d’imagerie multiphotonique intravitale des artères collatérales, il est possible d’analyser l’adhérence et l’extravasation de toutes les cellules sanguines in vivo en modifiant le marqueur des anticorps.
